高壓氧對腦卒中后大鼠神經功能的作用

馬明明 王雪晶 李 瑋 張杰文△

1）河南省人民醫院 鄭州 450003 2）鄭州大學第一附屬醫院神經內科 鄭州 450052

缺血性腦血管病是一類嚴重危害人類健康的常見病，具有發病率、病死率、致殘率、復發率高的特點，給社會和家庭帶來沉重的負擔［1］。雖然超早期溶栓和急性期神經元保護取得重要進展，但對于大多數患者而言，腦卒中后癱瘓肢體的康復仍不理想。為探討高壓氧治療對急性缺血性腦卒中后神經系統功能的影響，本研究選取SD大鼠成功建立線栓法大腦中動脈閉塞模型，在術后3h對HBO組大鼠開始高壓氧治療。梗死后5d、10d、14d以橫木行走試驗進行神經功能評分，同時進行TTC染色與梗死體積測量。觀察高壓氧對腦卒中大鼠神經功能恢復和梗死灶體積的影響，為進一步研究HBO治療機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：SPF級SD大鼠48只，均為雄性，鼠齡3～4個月，體質量（315±20）g。實驗動物均由鄭州大學醫學院實驗動物中心提供，檢疫后備用。

1.1.2 儀器和試劑：YC32190／0.3－22型高壓氧艙系煙臺冰輪高壓氧艙有限公司生產，10%水合氯醛由河南省人民醫院藥劑科配置；4%多聚甲醛購自天津北聯精細化學品有限公司。TTC（triphenyltetrazolium chloride，氯化三苯四唑）染色試劑購自北京中山生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組：將48只大鼠隨機分成假手術組、模型組、HBO組，每組16只。①假手術組：僅分離頸總及頸外動脈，不插入尼龍線結扎大腦中動脈；②模型組：只造模，不做其他處理；③HBO組：造模后進行高壓氧治療。

1.2.2 模型制備：將模型組及 HBO組大鼠32只用線栓法［2］制成大腦中動脈梗死模型。在大鼠頸外動脈分叉處結扎頸外動脈，在近心端結扎頸總動脈，在頸總動脈近頸內、頸外動脈分叉處剪一小口，將尼龍線（直徑0.188mm）順勢緩慢插入大腦中動脈，栓塞大腦中動脈起始端的血流，然后以尼龍線結扎頸總動脈。如大鼠蘇醒后向右旋轉或右側肢體癱瘓則視為栓堵成功并入選實驗。

1.2.3 高壓氧處理：術后3h動物進艙，先用純氧充分洗艙30min，新鮮鈉石灰顆粒吸收CO2。按100kPa（1ATA）／min速率加壓至0.25MPa，在高壓下停留1h，后以0.25ATA／min速度勻速減壓至常壓并出艙活動，隔天1次，共暴露8次［2］。假手術組及模型組大鼠在同時段模擬進出艙活動。

1.2.4 大鼠肢體功能評分：在大腦中動脈梗死術后第5、10、14天對模型組及HBO組大鼠進行橫木行走試驗（beam walking test，BWT）評分法［3］，以判斷肢體功能恢復的程度。

1.2.5 TTC染色和梗死灶體積測量：假手術組、模型組和HBO組術后24h與梗死后5d、10d、14d每組大鼠不同時間點處死，每個時間點每組大鼠取3只立即斷頭取腦，剝離血管和硬腦膜后，觀察梗死灶外觀。置于2%TTC溶液中，37℃避光恒溫箱孵育30min，取出腦，放在－20℃冰箱10 min。待腦組織稍硬后，使用鋒利刀片，由腦的前極向后極冠狀切片，片厚約2mm，再置于2%TTC溶液中，37℃避光溫育30min，然后轉移至用PBS配置的4%多聚甲醛中固定。取最大層面，觀察梗死灶面積，計算腦缺血梗死體積，并觀察神經元損傷情況，計算其占據左半球的百分比。照片掃描后用Leica圖像處理系統測定切片的腦梗死面積，利用既往公式［4］算出梗死區及缺血對側腦片體積，利用梗死體積百分比（梗死體積／對側腦片體積×100%）表示損傷程度。

1.3 統計學處理 全部數據應用SPSS 13.0統計軟件進行統計分析。采用方差分析和t檢驗，比較模型組、對照組和HBO組不同時間點大鼠肢體功能評分和梗死灶體積，以表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 術后大鼠肢體功能評分 按照平衡木試驗評分，結果如表1所示。術后第5天模型組與HBO組評分差異無統計學意義（P＞0.05），模型組與 HBO組肢體功能恢復差異無統計學意義；術后第10、14天模型組與HBO組評分差異有統計學意義（P＜0.05），HBO組肢體功能恢復較模型組好。HBO組及模型組術后第10天評分較第5天評分差異有統計學意義（P＜0.05），第10天肢體功能較第5天有所改善；術后第14天評分較第10天評分差異有統計學意義（P＜0.05），第14天肢體功能均較第10天有所改善。見表1。

表1 2組腦梗死大鼠平衡木試驗評分比較 （）

表1 2組腦梗死大鼠平衡木試驗評分比較 （）

注：與 HBO 組相比，＊P＜0.05；與第5天相比，＃P＜0.05；與第10天相比，△P＜0.05

14d組別 肢體功能評分術后5d 術后10d 術后△＊△模型組 4.43±0.22 3.20±0.36＊＃ 2.80±0.14 HBO組 4.38±0.34 2.41±0.36＃ 2.05±0.31

表2 2組大鼠腦梗死體積比較 （）

表2 2組大鼠腦梗死體積比較 （）

注：與 HBO組相比，＊P＜0.05；與第5天相比，＃P＜0.05

14d組別 腦梗死體積／%術后5d 術后10d 術后＊模型組 36.58±4.49 29.85±3.64＊＃ 26.48±4.46 HBO組 39.54±5.95 23.47±4.36＃20.59±5.25

2.2 梗死灶體積 TTC染色顯示大鼠左側大腦出現梗死灶，梗死區域神經元大量死亡，染色較淡。梗死灶以額葉、頂葉、顳葉大腦皮質為主。用TTC染色分析的方法［4］對不同時期梗死體積進行測量。假手術組無梗死灶形成。如表3所示，模型組、高壓氧組在腦梗死后無顯著差異，從MCAO后24 h開始進行不同刺激，于不同時間點進行觀測，結果發現，從第5天開始，高壓氧組梗死體積均較模型組明顯縮小（P＜0.05），此現象一直持續至第14天。不同時間點上看，隨著時間延長，梗死灶體積逐漸減少，但第14天和第10天相比2組梗死灶體積差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

3 討論

高壓氧治療急性缺血性腦卒中動物實驗研究證實，HBO治療急性缺血性腦卒中模型，特別是缺血再灌注模型療效顯著，而對于大血管永久性阻塞模型的療效還有爭議［5－6］。目前研究證實，高壓氧治療急性缺血性腦卒中的機制有多種：高壓氧可通過改善缺血細胞代謝，清除氧自由基以及保護梗死周圍缺血半暗帶組織等改善腦梗死的預后［7－9］。但目前大多數臨床觀察還未充分證實急性腦梗死后高壓氧治療的有效性［10］。

本研究以線栓法成功制作大腦中動脈閉塞模型，術后3 h開始給予多次高壓氧治療，發現梗死后第10、14天高壓氧組比模型組的神經功能恢復更加明顯，證實早期開始高壓氧治療能夠改善大腦中動脈永久閉塞大鼠神經功能，與Yin等［11］報道一致。用TTC染色方法，對不同時期梗死體積進行測量，結果發現從第5天開始，高壓氧組梗死體積明顯縮小（P＜0.05），此現象一直持續至第4周；從第5天開始2組梗死體積均較刺激前明顯縮小，但第14天與第10天相比梗死灶體積仍然減小，差異無統計學意義（P＞0.05）。可能因為MCAO第5天大鼠的組織水腫較明顯，由于高壓氧的干預，可明顯減輕組織水腫程度，從而明顯減輕梗死灶體積。而在第14天，各組梗死灶體積和第10天已無明顯差距，說明第2周梗死區域已發生軟化壞死，梗死灶體積無顯著改變。這提示我們，腦梗死后高壓氧治療要及早進行，從24h即開始干預可最大限度降低梗死面積，其機制在于此時梗死灶尚未開始軟化，瀕臨壞死的神經元能夠得到挽救，從而減少半暗帶面積，限制腦梗死進一步發展。這可能與高壓氧能夠改善腦部缺氧、維持血腦屏障完整性、減少細胞凋亡和增加神經再生有關［12］。確切治療機制有待于進一步研究。

綜上所述，腦梗死早期開始高壓氧治療能夠顯著提高永久性閉塞腦梗死后大鼠神經功能評分，減小梗死灶體積，改善預后。腦梗死后給予高壓氧治療可能通過改善腦部缺氧、維持血腦屏障完整性、減少細胞凋亡和增加神經再生等促進腦梗死后的神經可塑性。此研究可能為臨床上腦梗死患者盡早高壓氧治療提供理論依據。

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