龍芽楤木皂苷對培養心肌細胞鈉通道電流的影響

張雨薇，馬麗娟，李秋元，趙春燕，孫世曉

(1．黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040;2．浙江醫學高等專科學校，浙江 杭州 310053;3．吉林大學白求恩醫學部，吉林 長春 130021)

我國是心血管病高發地區，其中很多疾病發展到終極階段，會演變為后果相當危險的充血性心力衰竭。究其原因是由于心肌收縮力的嚴重下降，進而射血能力減弱，最后會累及全身各大器官、系統，甚至衰竭。因此，迫切需要找到一些新的藥品，從增強收縮力的角度來治療該疾病。這種強心治療的方法在很多的國家都還在應用，用來改善心功能，用后取得了一定的效果。

五加科藥用植物－龍芽楤木(Aralosides As)莖葉中存在的主要物質是皂苷［1］。據報道，As對心血管系統產生了多方面的作用，其作用之一是正性肌力作用。這個結論來源于對很多實驗模型的觀察研究:如利用蛙離體肌肉標本，貓、犬、大鼠的心臟模型，Langendorff技術灌流離體大鼠心臟模型，觀察其對收縮性的直接影響［2－5］，皆觀察到 As顯現出正性肌力作用，但是以往沒有實驗從心肌膜上鈉離子改變的角度探討其實現強心作用的機制。本研究旨從分子水平上對其作用機制作進一步闡述，希望能為該藥開發為具有自主知識產權的藥物提供新的理論依據。

1 材料和方法

1．1 材料 AS(由吉林大學生理實驗室提供);DMEM(博大生物公司);胰蛋白酶(Sigma公司);新生胎中血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);其余試劑物為國產分析純。

1．2 細胞培養方法［6］

1．3 用膜片鉗記錄鈉離子流［7］

先將玻璃毛坯夾到預熱的微電極拉制器上，拉制成毛坯尖端內徑1μm左右，再進行拋光。在電極內通過虹吸的原理用注射器充上電極液，如發尖端有氣泡存在，輕彈毛坯除去。另外還要盡量保持電極的潔凈，控制胞內液的成分及pH值，是通過微電極的細胞內透析實現的。在記錄電流以前，在浴液和電極液中預先加入了一些阻斷其他離子的阻斷劑，并且通過實驗證明河豚毒素可阻斷該電流。因此，確保記錄中得到的是純凈的Ina。

1．4 實驗分組 以隨機選取生長狀態良好、中等大小的心室肌細胞為研究對象，分對照組、As不同劑量組，在浴液中分別加入 As1μg/ml，10μg/ml，100μg/ml后，觀察給藥前后INa幅值變化。

1．5 數據分析處理

實驗數據的統計用(均數±標準差)表示，采用t檢驗分析實驗數據。

2 結果

2．1 不同濃度的As對INa的影響 見表1，圖1。

實驗結果顯示，As中、高組明顯升高鈉電流幅值，組間有明顯的差異。

A鈉電流對照曲線B、C、D分別為不同As劑量組(1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml)作用后曲線。

2．2 未加藥組和加As組對心肌細胞INa的電流－電壓曲線影響

記錄Ina時的儀器參數:如保持電位、去極化電位、波寬等［8］，當細胞和電極達到良好封接后，在不同激活電壓下開始記錄電流。記錄到INa幅值作出電流－電壓曲線(圖2)，結果發現，As除可使電流幅值增高，其他參數沒變化。

表1 正常對照組和不同濃度的AS對培養乳鼠心肌細胞Na+通道的影響(n=10,±s)

表1 正常對照組和不同濃度的AS對培養乳鼠心肌細胞Na+通道的影響(n=10,±s)

注:與對照組相比較，＊＊P ＜0．01

分組 激活電壓(mV)電流幅值(nA)電壓峰值(mV)反轉電壓(mV)未處理組 －55to60 －4．070±1．278 －40 0 1 －55to60 －4．250±1．530 －40 0 10 －55to60 －5．239±1．757＊＊ －40 0 100 －55to60 －5．720±1．689＊＊ －40 0

圖1 不同濃度的As對Ina幅值的影響

圖2 As低、中、高劑量對心肌細胞INa的電流－電壓曲線影響

3 討論

很多文獻［2－5］顯示，As在不同的動物模型都顯現出強心的效應。但是，在培養心肌細胞液中加入As，從離子通道水平上進行研究其強心作用，并未見報道。所以，在實驗中以膜片鉗技術作為研究手段，直接有效的觀察了As對膜鈉通道電流產生的影響，探討其正性肌力作用的可能機制。

鈣離子對心肌生物電的形成至關重要，其一可參與心室肌細胞動作電位的形成，在平臺期內流，進而發揮觸發興奮－收縮耦聯的作用。心肌的收縮過程是通過興奮收縮－耦聯過程引起，帶動肌絲滑行實現的。因此，胞漿中Ca2+濃度的高低對心肌的收縮和舒張起著關鍵性的作用，Chu等也觀察到鈣離子的濃度在觸發心肌收過程中起關鍵作用［9］。胞漿中鈣濃度增加的途徑可以是外鈣內流產生的，也可以是細胞內肌質網釋放的，還可能是通過膜上的鈉鈣交換體進入的［10］。

本實驗觀察了不同濃度As對鈉電流影響，在實驗中盡量避免和減少Run－down［11］，記錄結果均取自封接穩定后5min的結果。結果中、高濃度的As劑量依賴性的對鈉通道電流產生明顯作用，其可使鈉電流幅值增大。所以，As具有正性肌力作用機制之一是可能由于藥物作用于細胞膜，使得膜對鈉離子的通透性增加，順濃度差鈉離子內流，增加了胞漿中鈉離子，激活了反向的鈉－鈣交換機制，進而細胞內鈣會增加，影響興奮－收縮藕聯過程，進而實現其強心作用。關于As升高心肌細胞內鈣的其他分子機制，尚待進一步研究。

充血性心力衰竭發生后，機體的血流動力學發生明顯紊亂，心肌既表現出負性肌力作用，也存在明顯的舒張障礙。所以，當充血性心力衰竭發展到嚴重階段，強心治療來改善整個的心功能意義重大。這種方法在很多國家仍在應用，存在明顯優勢，但以往很多的強心藥如洋地黃、磷酸二酯酶抑制劑、鈣增敏劑等通過不同的機制實現強心［12］。但是，有的副作用大，有的僅能增強收縮力，卻無法改善舒張功能，限制了它們的應用。因此，迫切需要尋找出更多更好的其他類型的藥物，治療慢性心力衰竭。以往的實驗結果顯示［7］，As對心肌既有正性肌力作用，還有其他的優勢。因此，此實驗為其作為新一代強心藥應用提供了一些線索和實驗室依據。

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