止咳平喘膠囊的藥效學(xué)研究

劉弘濤，李鳳金，劉錦泉，張玉昆，牛雯穎，肖洪彬

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

止咳平喘膠囊是臨床經(jīng)驗方。主要含有麻黃、陳皮、貝母、苦杏仁、石膏、甘草、紫菀、桑葉、款冬花、元柏等。用于肺熱感冒引起的咳嗽痰喘的治療，具有清肺、祛痰、抗炎、抑菌的功效。本實驗主要針對該藥進行了止咳、平喘、祛痰、抗炎、抑菌等方面的藥效學(xué)研究，為止咳平喘膠囊的臨床應(yīng)用提供藥效學(xué)依據(jù)。

1 材料

1．1 藥物

止咳平喘膠囊(由麻黃15g，陳皮15g，貝母15g，苦杏仁 10g，石膏 15g，甘草 15g，紫菀 15g，桑葉 15g，款冬花15g，黃柏15g組成。口服，每次4～8粒，每日3次。或遵醫(yī)囑。規(guī)格:每粒裝0．3 g。由鄭慶海中醫(yī)內(nèi)科診所提供);橘紅膠囊(四川美大康藥業(yè)股份有限公司，國藥準字Z20010005，每粒0．5g;口服，1 次5 粒，每日2次)。

1．2 試劑

碳酸氫鈉(天津東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠，批號20080608);苯酚紅(北京化工廠，批號:840920);氨水(哈爾濱市化工試劑廠，批號20081118);二甲苯(北京化工廠，批號20061123);氯化鈉(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號20080310);磷酸組胺(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號20090915);脂多糖(sigma化學(xué)試劑有限公司，批號20100368)。

1．3 實驗動物

昆明種小白鼠，體質(zhì)量18～22g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心繁殖提供，合格證為 SCXK(黑)2008004;健康豚鼠，體質(zhì)量(190±20)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心繁殖提供，合格證為SCXK(黑)2008004。

金黃色葡萄球菌、肺炎雙球菌、乙型溶血性鏈球菌由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心微生物實驗室提供。

1．4 主要儀器

722型可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司);分析天平(梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司);HTC－150恒溫恒濕培養(yǎng)箱(上海三騰儀器有限公司);YXQ－SG46－280手提式高壓滅菌鍋(上海比朗儀器有限公司);BSW－100型超聲霧化器(深圳貝爾醫(yī)療器械有限公司)。

2 實驗方法

2．1 鎮(zhèn)咳作用

采用小鼠氨水引咳法［1］。昆明種小鼠50只，雌雄各半，按體重隨機分成空白對照組、陽性對照組(橘紅膠囊，0．65g/kg)、止咳平喘膠囊高劑量組(4．0g/kg)、止咳平喘膠囊中劑量組(2．0g/kg)、止咳平喘膠囊低劑量組(1．0g/kg)，每組10只。將藥物制成混懸液，連續(xù)口服給藥7天，末次給藥2h后，把小鼠放入懸掛吸有0．5ml濃氨水濾紙片的玻璃罩內(nèi)引咳30s，迅速取出，放入燒杯內(nèi)，觀察小鼠出現(xiàn)腹肌收縮、縮胸、張大嘴(咳聲有無均可)作為咳嗽標準，記錄5min中的咳嗽次數(shù)和咳嗽潛伏時間(S)。

2．2 祛痰作用

采用小鼠酚紅祛痰法［2］。昆明種小鼠50只，雌雄各半，實驗分組、給藥劑量同上。禁食不禁水8～12h，給藥2h 后，腹腔注射 0．5% 酚紅溶液 0．5ml，0．5h 后脫頸椎處死小鼠，背位固定，分離氣管，于喉頭下將磨平頭的7號針頭插入氣管內(nèi)約0．3cm，用絲線結(jié)扎固定，用1ml注射器吸取0．5ml 5%碳酸氫鈉溶液，通過針頭來回灌洗呼吸道3次(每次不作停留)，將灌洗液注入試管內(nèi)，重新吸取碳酸氫鈉0．5ml，如上再灌洗3次，3次共用洗液1．5ml，抽洗9次，將3次的洗液合并置比色管中，用分光光度計測定吸光度A546。

2．3 抗炎作用

采用小鼠耳腫脹法［1］。昆明種小鼠50只，雌雄各半，實驗分組、給藥劑量同上。口服給藥1h后，每只小鼠右耳廓兩面均勻涂抹0．02ml二甲苯致炎。4h后脫頸處死小鼠，沿耳廓基線剪下兩耳，用9mm的打孔器分別在同一部位打下耳片，用分析天平稱取質(zhì)量，每只鼠的右耳片重量減去左耳片重量即為腫脹度，并計算腫脹率。

2．4 解熱作用

采用內(nèi)毒素致熱法［2］。取大鼠60只，按體質(zhì)量隨機分成止咳平喘膠囊高(2．8g/kg)、中(1．4g/kg)、低(0.7g/kg)劑量組，陽性對照組(橘紅膠囊0．46g/kg)、模型對照組和空白對照組，雌雄各半。先用肛溫計測量每只鼠正常肛溫(肛溫計插入肛門內(nèi)1．5cm)二次，記錄各組小鼠初始體溫，求其平均值作為正常體溫，計算均值標準差確定無組間差異，禁食不禁水12h后分別灌胃給藥和生理鹽水(空白對照組和模型對照組)。灌胃給藥40nim后，腹腔注射脂多糖(0．66mg/kg)致熱，給致熱劑后每隔1h測定各組大鼠體溫，記錄體溫變化。

2．5 平喘作用

采用豚鼠乙酰膽堿、磷酸組胺引喘法［2］。取一定數(shù)量健康豚鼠，將每只豚鼠置于4L密閉的玻璃鐘罩內(nèi)，待安靜后，400mmHg的壓力噴入2%氯化乙酰膽堿和0.1%的磷酸組胺等體積混合15s，進行預(yù)挑選。噴霧停止后，觀察6min內(nèi)豚鼠引喘的潛伏期，即噴霧停止后，出現(xiàn)喘息性抽搐的時間。潛伏期超過120s的不敏感豚鼠不予選用。第2天，將預(yù)選合格的豚鼠50只隨機分為5組，按體質(zhì)量隨機分成空白對照組、陽性對照組(橘紅膠囊0．39g/kg)、止咳平喘膠囊高(2．4g/kg)、中(1．2g/kg)、低(0．6g/kg)劑量組，每組 10 只。各給藥組口服給藥，每日1次，連續(xù)2天。末次給藥后2h和4h后，重復(fù)上述引喘方法，記錄6min內(nèi)豚鼠引喘的潛伏期(引喘潛伏期超過6min者，則其引喘潛伏期以360s計算)。

2．6 抑菌實驗

采用濾紙片擴散法［3］。肉湯瓊脂培養(yǎng)基制備:蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂20g，加入肉浸液1 000ml內(nèi)，加熱融化后過濾，調(diào)節(jié)pH值為7．6，15磅高壓滅菌20min，趁熱將培養(yǎng)基倒入預(yù)先滅菌的培養(yǎng)皿內(nèi)約4mm厚，冷卻后即成。受試藥物處理:取止咳平喘膠囊或橘紅膠囊內(nèi)容物5g，加水至25ml，超聲波超聲10min后離心，取上清液調(diào)pH值為7．0(中性)、滅菌、備用。受試菌種:金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus au-reus Rosenbach ATCC 6538)，肺炎雙球菌(Pneumococ-cus ATCC 49619)，乙型溶血性鏈球菌(beta hemolytic streptococcus ATCC 32204)。

方法:將已經(jīng)孵育16h的新鮮菌液用接種環(huán)均勻劃線接種于肉湯瓊脂培養(yǎng)基上，取直徑7mm的圓形濾紙片用受試藥液浸透后均勻地貼在平板培養(yǎng)基上，其中陰性對照組濾紙片蘸無菌鹽水后分別置于三種菌種的平板上;陽性對照組濾紙片上蘸有無菌的橘紅膠囊提取液(原液)后分別置于三種菌種的平板上;受試藥物組濾紙片上蘸有無菌的止咳平喘膠囊提取液(其中高劑量組蘸取原液、中劑量組蘸取原液的2倍稀釋液、低劑量組蘸取原液的4倍稀釋液)置于三種菌種的平板上。37℃培養(yǎng)24h后測定抑菌圈直徑大小，評價抑菌作用的強弱。

3 結(jié)果

3．1 止咳平喘膠囊對小鼠鎮(zhèn)咳作用 結(jié)果見表1。

注:與空白對照組比較，*P ﹤0．05 ，＊＊P ﹤0．01。

表1結(jié)果表明，止咳平喘膠囊劑高、中、低劑量組與空白對照組相比，能明顯的增加小鼠咳嗽的潛伏期和降低小鼠的咳嗽次數(shù)(P＜0．05或P＜0．01)。說明止咳平喘膠囊有明顯的鎮(zhèn)咳作用。

3．2 止咳平喘膠囊對小鼠的祛痰作用 結(jié)果見表2。

表2結(jié)果表明，各給藥組同空白對照組比較，止咳平喘膠囊高、中、低劑量組和陽性對照組對小鼠呼吸道酚紅的排泄量有增加的趨勢，但無明顯的差異性(P＞0．05)。

表2 止咳平喘膠囊對小鼠酚紅排泄量的影響(±s，n=10)

表2 止咳平喘膠囊對小鼠酚紅排泄量的影響(±s，n=10)

3．3 止咳平喘膠囊抗炎作用 結(jié)果見表3。

組別 劑量(g/kg) OD值 酚紅量(ug/ml)空白對照組 － 0．223 ±0．097 2．03 ±0．69高劑量組 4．0 0．289 ±0．090 2．32 ±0．66中劑量組 2．0 0．298 ±0．089 2．40 ±0．65低劑量組 1．0 0．319 ±0．120 2．62 ±0．87陽性對照組0．65 0．289 ±0．068 2．34 ±0．50

表3 止咳平喘膠囊對二甲苯致炎小鼠耳腫脹程度的影響(±s，n=10)

表3 止咳平喘膠囊對二甲苯致炎小鼠耳腫脹程度的影響(±s，n=10)

注:與模型對照組比較，*P ﹤0．05，＊＊P ﹤0．01

組別 劑量(g/kg)左耳片質(zhì)量(mg)右耳片質(zhì)量(mg)左右耳差值(mg)模型對照組 － 9．25 ±1．25 15．88 ±3．23 6．63 ±3．26高劑量組 4．0 10．82 ±0．89 12．59 ±1．15 1．77 ±0．86＊＊中劑量組 2．0 12．01 ±1．44 14．36 ±2．03 2．35 ±1．17＊＊低劑量組 1．0 12．01 ±0．86 16．04 ±2．40 4．03 ±2．39*陽性對照組 0．65 12．76 ±1．09 16．05 ±1．81 3．29 ±1．63*

表3結(jié)果表明，各給藥組同模型對照組比較，止咳平喘膠囊高、中、低劑量組和陽性對照組小鼠的左右耳差值重量明顯減輕(P＜0．05或P＜0．01)，表明止咳平喘膠囊能降低小鼠耳腫脹程度。說明止咳平喘膠囊具有一定抗炎作用。

3．4 止咳平喘膠囊解熱作用

表4結(jié)果表明，各組動物的正常體溫(0h)無明顯的差異性(P＞0．05)，給致熱劑后模型對照組的不同時間體溫明顯高于空白對照組(P＜0．01或P＜0.05)。而不同時間各給藥組分別同模型對照組比較，給致熱劑后1h、2h、3h，各給藥組體溫明顯降低(P＜0．01或P＜0．05);給致熱劑后 4h，止咳平喘膠囊各組體溫明顯降低(P＜0．01或P＜0．05)，而陽性對照組無明顯的差異性(P＞0．05);給致熱劑后5h、6h，止咳平喘膠囊高劑量組體溫明顯降低(P＜0．01)，其他各組無明顯的差異性(P＞0．05);表明止咳平喘膠囊可抑制脂多糖引起的大鼠體溫升高，作用時間可達6h以上，具有明顯的解熱作用。

表4 止咳平喘膠囊對內(nèi)毒素致小鼠發(fā)熱的影響(±s，n=10)

表4 止咳平喘膠囊對內(nèi)毒素致小鼠發(fā)熱的影響(±s，n=10)

注:與模型對照組在相同時間比較，*P﹤0．05，＊＊P﹤0．01。

組別 給藥前體溫(℃)給致熱后體溫變化(℃)1h 2h 3h 4h 5h 6h空白對照組 36．93 ±1．18 37．44 ±0．56＊＊ 37．34 ±0．52＊＊ 36．89 ±0．69＊＊ 37．10 ±0．69* 36．82 ±0．67* 36．78 ±0．66*模型對照組 36．99 ±0．85 38．71 ±0．60 39．04 ±0．51 38．40 ±0．74 37．88 ±0．51 37．56 ±0．67 37．62 ±0．92高劑量組 36．88 ±1．10 37．39 ±0．60＊＊ 36．80 ±0．55＊＊ 37．31 ±0．68＊＊ 36．94 ±0．71＊＊ 36．20 ±0．73＊＊ 36．55 ±0．69*中劑量組 36．99 ±0．96 38．23 ±0．40* 37．88 ±0．72＊＊ 37．64 ±0．57* 37．14 ±0．70* 37．34 ±1．06 37．08 ±0．69低劑量組 36．94 ±0．97 37．87 ±0．74＊＊ 37．55 ±0．70＊＊ 37．04 ±0．76＊＊ 36．69 ±0．50＊＊ 37．12 ±0．71 37．39 ±0．72陽性對照組 37．12 ±0．73 37．92 ±0．89* 37．98 ±0．65＊＊ 37．64 ±0．56*37．54 ±0．85 36．60 ±1．08 37．03 ±1．17

表5 止咳平喘膠囊對豚鼠哮喘潛伏期的影響(±s，n=10)

表5 止咳平喘膠囊對豚鼠哮喘潛伏期的影響(±s，n=10)

注:與給藥前比較，*P ﹤0．05，＊＊P ﹤0．01;與空白對照組比較，☆P ﹤0．05，☆☆P ﹤0．01。

組別 劑量(g/kg) 藥前引喘潛伏期(S) 藥后2h引喘潛伏期(S) 藥后4h引喘潛伏期(S)空白對照組61．56 ±9．62 61．67 ±7．20 61．93 ±8．24高劑量組 2．4 61．87±11．58 76．11±12．02＊＊☆☆ 90．84±11．64＊＊☆☆中劑量組 1．2 60．42±9．71 72．05±10．31＊☆ 74．90±12．47＊☆低劑量組 0．6 60．84 ±8．55 67．37 ±11．04 68．52 ±14．61陽性對照組 0．39 57．81 ±8．42 66．49 ±9．59* 77．60 ±15．06＊☆☆

3．5 止咳平喘膠囊對豚鼠的平喘作用

表5結(jié)果表明，給藥前各組之間引喘潛伏期無明顯的差異性(P＞0．05);給藥后2h和4h分別同給藥前比較，低劑量組有增加的趨勢，但無明顯的差異性(P＞0．05);而高、中劑量組和陽性對照組的引喘潛伏期明顯延長(P＜0.05或P＜0．01);給藥后2h和4h，各給藥組分別同空白對照組比較，止咳平喘膠囊高、中劑量組和陽性對照組均可使引喘潛伏期明顯延長(P＜0．05或P＜0．01)，低劑量組有延長的趨勢，但無明顯的差異性(P＞0．05)。表明止咳平喘膠囊有一定的平喘作用。

3．6 止咳平喘膠囊抑菌作用 結(jié)果見表6。

表6 止咳平喘膠囊對呼吸道菌生長的影響(±s，n=9)

表6 止咳平喘膠囊對呼吸道菌生長的影響(±s，n=9)

組別 金黃色葡萄球菌(mm)肺炎雙球菌(mm)乙型溶血性鏈球菌(mm)陰性對照組0 0 0高劑量組 16．31 ±0．65 16．42 ±0．44 20．01 ±1034中劑量組 12．70 ±1．43 12．28 ±1．18 15．94 ±1．45低劑量組 8．98 ±0．96 8．41 ±0．85 12．72 ±0．81陽性對照組15．13 ±1．03 14．90 ±1．32 18．50 ±1．00

表6結(jié)果表明，陰性對照濾紙片周圍均生長細菌，而止咳平喘膠囊高、中、低劑量對金黃色葡萄球菌、肺炎雙球菌、乙型溶血性鏈球菌均有一定的抑菌效果，從抑菌環(huán)大小來看，三個劑量組有明顯的劑量關(guān)系。表明止咳平喘膠囊具有明顯的體外抑菌作用。

4 討論

經(jīng)主要藥效學(xué)實驗證明，止咳平喘膠囊口服給藥，對氨水引起的小鼠咳嗽次數(shù)明顯減少、咳嗽潛伏期明顯延長，具有止咳作用;可使小鼠呼吸道酚紅排出量增加，具有祛痰作用;對二甲苯引起的小鼠耳腫脹有明顯的抑制作用，具有抗炎作用;對乙酰膽堿和磷酸組胺引起的豚鼠喘息時間有延長作用，具有平喘作用;對脂多糖引起的小鼠發(fā)熱有明顯的抑制作用，具有解熱作用。體外實驗證明，止咳平喘膠囊對金黃色葡萄球菌、肺炎雙球菌、乙型溶血性鏈球菌均有一定的抑菌效果［4，5］。表明止咳平喘膠囊具有止咳、祛痰、平喘、抗炎、解熱和抑菌作用。

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