蟬蛻不同提取工藝抗凝與纖溶活性比較研究

曹唯儀，黃鎮林，何亮穎，趙韶華，王玉蓉

(1.北京中醫藥大學中藥學院，北京 100102;2.河北以嶺醫藥集團有限公司，河北 石家莊 050035)

蟬蛻(Cryptotympana pustulate Fabricius)為蟬科昆蟲黑蚱羽化時脫落的皮殼，性寒、味咸，辛涼解表，長于疏風清熱、明目退翳、透疹止癢、利咽、解痙。臨床多用于治療風熱感冒、咽痛音啞、麻疹不透、風疹瘙癢、目赤翳障、驚風抽搐及破傷風等，為中國藥典2010年版(一)部收載［1］。現代藥理學研究表明，蟬蛻除具有解熱、鎮痛、鎮靜、抗驚厥、解痙等作用外，還具有一定的抗凝作用，如蟬蛻水提液可顯著降低高脂血癥大鼠紅

基金項目:北京中醫藥大學復方中藥制藥研究創新團隊資助項目(2011-CXTD-13)

作者簡介:曹唯儀(1989-)，女，北京中醫藥大學2011級中藥制藥學專業碩士研究生，主要研究方向:中藥復方新型釋藥系統研究。

通訊作者:王玉蓉(1951-)，女，教授，博士研究生導師，主要研究方向:中藥復方新型釋藥系統研究。

收稿日期:2012-07-12

修回日期:2012-08-10

細胞聚集指數

［2］

，抵抗體外血栓形成，并能明顯緩解哮喘的“微觀血瘀”狀態

［3］

。臨床研究發現，蟬蛻與水蛭、?蟲、全蝎等配伍同用，能明顯抑制血栓形成和血小板聚集，延長凝血時間，對絡脈瘀阻的心血管系統疾病有很好的治療作用

［4］

，但其有效物質基礎的研究報道尚少。為此，本研究擬通過凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、血小板聚集率和血凝-纖溶動態圖試驗，比較并綜合評價蟬蛻仿生胃/胰蛋白酶解物、水提物、醇提物、水提醇沉物抗凝纖溶活性，為蟬蛻工藝篩選和抗凝物質基礎的研究奠定基礎。

1 儀器、試藥與動物

1.1 儀器 800B型離心機(上海安亭科學儀器廠);ES-120型電子分析天平(長沙湘平科技發展有限公司);恒溫水浴鍋(余姚市東方電工儀器廠);DZ-1BC型真空干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司);LGPABER-Ⅰ型血小板聚集儀(北京中勤世帝科學儀器有限公司)。

1.2 試藥 蟬蛻(由石家莊以嶺醫藥集團有限公司提供);胃蛋白酶1:10 000(Sigma P7000，北京環亞泰克生物醫學技術有限公司);胰蛋白酶1:250(Amresco0458，北京華美轉導科技有限公司);PT試劑盒(上海太陽生物試劑公司);APTT試劑盒(上海太陽生物試劑公司);乙醇(分析純);ADP(Sigma，北京環亞泰克生物醫學技術有限公司);烏拉坦(國藥集團化學試劑有限公司，分析純);枸櫞酸鈉(西隴化工股份有限公司，分析純)。

1.3 動物 家兔20只，購自北京海淀興隆實驗動物養殖場，體質量約2kg，雌雄各半，動物許可證號:SCXK(京)2011-0006。

2 方法

2.1 蟬蛻不同提取物的制備

2.1.1 仿生酶解［5］稱取蟬蛻藥材細粉8g于250mL圓底燒瓶，按固液比1∶20加入人工胃液(取鹽酸9mL，加蒸餾水稀釋成1 000mL，即得)，密閉，于37℃恒溫水浴作用30min后，加入3.0%胃蛋白酶水解3h，將酶解液置于85℃恒溫水浴作用15min滅酶，冷卻至室溫，以4 500r/min離心15min，取上清液水浴揮干，即得蟬蛻胃蛋白酶酶解物。殘渣稱重按固液比1∶20加入人工腸液(取 0.2mol/L磷酸二氫鉀溶液 250mL，加0.2mol/L溶液118mL，用水稀釋至1 000mL，搖勻，即得)，密閉，于45℃恒溫水浴作用30min后，加入5%胰蛋白酶水解4h，將酶解液于85℃恒溫水浴作用15min滅酶，冷卻至室溫，以4 500r/min離心15min，取上清液，干燥即得蟬蛻胰蛋白酶酶解物。

2.1.2 水提取 稱取蟬蛻藥材細粉8g于250mL圓底燒瓶，按固液比1∶20加蒸餾水，回流提取3次，每次2h，合并提取液，干燥，即得蟬蛻水提物。

2.1.3 乙醇提取 稱取蟬蛻藥材細粉8g于250mL圓底燒瓶，分別按固液比1∶20加乙醇70%、90%乙醇回流提取3次，每次1h，合并提取液，回收干燥，即得蟬蛻70%、90%醇提物。

2.1.4 水提醇沉 稱取蟬蛻藥材細粉8g于250mL圓底燒瓶，按固液比1∶20加蒸餾水，回流提取3次，每次1h，合并提取液，濃縮至藥液比1∶1，加入95%乙醇至含醇量70%，置冰箱中放置過夜后4 500r/min離心15min，取上清液回收干燥，即得蟬蛻70%水提醇沉物。同法操作，加入95%乙醇至含醇量90%，置冰箱中放置過夜后4 500r/min離心15min，取上清液回收干燥，即得蟬蛻90%水提醇沉物。殘渣干燥，即得醇沉渣。

2.2 抗凝纖溶藥效試驗

2.2.1 供試品溶液的制備 取上述適量蟬蛻提取物，加生理鹽水或90%乙醇配制成濃度為10mg/mL溶液，即為供試品溶液。

2.2.2 血漿制備 取健康家兔(雌雄各半，產地北京)耳緣靜脈注射烏拉坦麻醉，頸動脈取血，3.8%枸櫞酸鈉抗凝(1∶9)，混勻后以1 000r/min離心10min，取上清液，即得富血小板血漿(PRP)，以3 000r/min離心10min，取上清液，即得貧血小板血漿(PPP)。

2.2.3 PT試驗［6］取 PPP100μL于測試杯中，加樣品液10μL，37℃預溫3min，加入 PT 試劑 200μL(預溫3min)，開始計時，至有纖維蛋白絲出現，準確記錄凝固時間。以生理鹽水或90%乙醇為陰性對照(每個樣品平行測定6份)。

2.2.4 APTT試驗［6］取 PPP100μL于測試杯中，加樣品液10μL，37℃預溫3min，加入 APTT試劑100μL(預溫 5min)，孵育 5min后加入 CaCl2100μL(預溫15min)，開始計時，至有纖維蛋白絲出現，準確記錄凝固時間。以生理鹽水或90%乙醇為陰性對照(每個樣品平行測定6份)。

2.2.5 血小板聚集率試驗［7］PPP調零后，將PRP 300μL與樣品液10μL置于測試杯中37℃預溫10min，加入誘導劑ADP(1mmol/L)10μL，測定10min內血小板最大聚集率。以生理鹽水或90%乙醇為陰性對照(每個樣品平行測定6份)。

血小板最大聚集率=PRP最大聚集時與基線之間的距離/90×100%

血小板聚集抑制率=(對照管血小板聚集率%-給藥管聚集率%)/對照管血小板聚集率% ×100%

2.2.6 血凝-纖溶動態圖試驗［7］取PRP 150μL與樣品液10μL混勻，37℃預溫10min，PPP調零，同時加入0.1mol/L CaCl250μL，攪動10s，平衡記錄儀記錄動態圖，直至圖形峰值持續穩定2min為止，以生理鹽水或90%乙醇為陰性對照(每個樣品平行測定6份)。所得曲線即為血凝-纖溶動態圖。根據動態圖觀察以下參數:

1)凝固啟動時間(CST):即從曲線開始前，與橫軸平行的直線線段。CST反映從凝固劑加入到纖維蛋白開始形成所需要的時聞，是體現血凝開始快慢的參數。2)最大凝固程度(MCE):即曲線上升的峰值段，也是開始凝固到凝固完全時透光度變化的峰值。MCE的高低與測定用血漿量，即纖維蛋白原水平有關。它表示液態的纖維蛋白原已基本凝固成凝膠態的纖維蛋白，凝固反應已基本完成。3)凝固時間(CT):即從曲線開始到曲線峰值所需的時間，CT是血漿開始凝固到凝固完全所需的時間，是反映血漿凝固快慢的參數。4)平均凝固速度(ACR):即MCE/CT的比值，代表平均每秒鐘形成的凝固程度，ACR是反映纖維蛋白形成，即血凝反應速度的參數。

圖1 纖溶圖示意圖CST:a-b;MCE:c-d;CT:b-c;ACR=MCE/CT

2.3 計算與統計 使用統計軟件SPSS 17.0對數據進行正態性檢驗，方差分析和雙側t檢驗，P＜0.05表示具有顯著性差異。

3 結果與討論

3.1 PT與APTT藥效考察 結果見表1。

表1 蟬蛻不同工藝提取物PT、APTT藥效考察(±s，n=5)

表1 蟬蛻不同工藝提取物PT、APTT藥效考察(±s，n=5)

注:與空白組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

提取物名稱 PT(s) APTT(s)生理鹽水對照組 胃蛋白酶解物6.99±0.14 15.61±1.44胰蛋白酶解物 6.99±0.18 31.00±1.19*水提物 7.45±0.20 32.70±1.10＊＊90%水提醇沉(渣)6.95±0.15 32.04±1.01＊＊生理鹽水(空白) 7.24±0.11 29.98±0.65 90%乙醇對照組 70%乙醇提取物 6.68±0.19 44.05±1.59 90%乙醇提取物 5.93±0.24 47.80±0.94 70%水提醇沉物 7.29±0.17 48.24±1.38 90%水提醇沉物 6.85±0.12 49.48±1.56 90%乙醇(空白)7.93±0.13 49.95±1.27

PT結果表明，所有蟬蛻提取物均不能明顯延長PT值，推測其抗凝作用可能與外源性凝血系統無關。

APTT結果表明，與生理鹽水對照，胰蛋白酶解物、水提物、90%水提醇沉(渣)可延長APTT，推測其可干擾內源性凝血因子的活性，達到抗凝作用。

3.2 血小板聚集率藥效考察 結果見表2。

表2 蟬蛻不同工藝提取物血小板聚集率藥效考察(±s，n=5)

表2 蟬蛻不同工藝提取物血小板聚集率藥效考察(±s，n=5)

注:與空白組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

提取物名稱 血小板聚集率(%)血小板抑制率(%)生理鹽水對照組 胃蛋白酶解物83.27±4.59 0.09胰蛋白酶解物 71.68±4.87＊＊ 0.22水提物 84.22±11.44 0.08 90%水提醇沉(渣)76.52±5.62* 0.16生理鹽水(空白) 91.33±11.78 0.00 90%乙醇對照組 70%乙醇提取物 17.63±3.17 -0.20 90%乙醇提取物 9.65±2.32＊＊ 0.34 70%水提醇沉物 14.72±2.85 0.00 90%水提醇沉物 24.10±3.43 -0.64 90%乙醇(空白)14.72±1.35 0.00

結果表明:與生理鹽水為對照，蟬蛻胰蛋白酶解物、90%水提醇沉(渣)具有顯著抑制血小板聚集的作用;與90%乙醇為對照，以90%醇提物抑制血小板聚集的作用最為明顯。

3.3 血凝-纖溶動態圖藥效考察 結果見表3。

表3 蟬蛻不同工藝提取物血凝-纖溶動態圖藥效考察(±s，n=5)

表3 蟬蛻不同工藝提取物血凝-纖溶動態圖藥效考察(±s，n=5)

注:與空白組比較，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01

提取物名稱 CST(s) CT(s) MCE(%) ACR(%/s)生理鹽水對照組 胃蛋白酶解物 306.50±15.60＊＊ 34.00±11.31*25.92±6.98 0.76胰蛋白酶解物 259.33±8.89 27.83±9.35 25.65±7.78 0.92水提物 212.50±6.38 24.00±3.03 43.88±10.66 1.83 90%水提醇沉(渣) 166.00±6.63 22.83±4.07 15.85±5.67* 0.69生理鹽水(空白) 259.33±7.23 22.00±2.90 35.07±15.43 1.59 90%乙醇對照組 70%乙醇提取物 256.33±10.63 4.83±2.48 5.08±3.52 1.05 90%乙醇提取物 253.50±7.40 4.67±2.94 5.35±4.39 1.15 70%水提醇沉物 254.50±5.47 4.17±1.17 5.10±4.09 1.22 90%水提醇沉物 269.33±6.09＊＊ 4.33±2.94 5.78±4.80 1.33 90%乙醇(空白)243.50±11.90 4.67±2.07 5.15±3.60 1.10

結果表明，與生理鹽水對照，蟬蛻胃蛋白酶解物、胰蛋白酶酶解物、90%水提醇沉(渣)不同程度的延長CT，降低MCE和ACR，而對CST的影響只有胃蛋白酶解物能夠顯著延長，胰蛋白酶酶解物延長并不顯著，說明蟬蛻胃蛋白酶解物、胰蛋白酶酶解物、90%水提醇沉(渣)提取方法主要是通過抑制纖維蛋白原轉化成纖維蛋白，減慢血漿凝固，達到抗凝效果。90%乙醇對照組中，只有90%水提醇沉物表現出延長CST作用，對CT、MCE、ACR 效果不顯著。

3.4 結論分析 結果如表4。

表4 蟬蛻不同提取方法抗凝指標綜合結果

結論:APTT實驗結果表明，胰蛋白酶解物、水提物和90%水提醇沉(渣)具有明顯的抗凝效果;血小板聚集率實驗表明，胰蛋白酶解物、90%醇提物和90%水提醇沉(渣)具有明顯的抗血小板聚集效果;血凝-纖溶動態圖藥效以平均凝固速度(ACR)值表明，胃/胰蛋白酶解物和90%水提醇沉(渣)效果最為明顯。

4 討論

本研究以PT、APTT、血小板聚集率、血凝-纖溶動態圖四項抗凝纖溶藥效為指標，考察了蟬蛻仿生酶解法、水提法、醇提法、水提醇沉法不同提取方法，得到8種提取物的抗凝纖溶效果。

由于提取物溶解度的不同，分別選用生理鹽水或90%乙醇作為對照組。結果顯示，生理鹽水溶解的各組對各項指標均優于90%乙醇組，推測原因可能是乙醇本身對血漿中凝血因子、血小板、蛋白質等物質有影響而造成的結果偏差。

結果表明，蟬蛻八種提取物對PT指標均無明顯作用，推測提取物均不是通過外源性凝血途徑抗凝，提示系通過內源性凝血途徑達到抗凝;APTT、血小板聚集率、血凝-纖溶三項指標顯示，仿生胃/酶蛋白酶解物和水提醇沉(渣)均表現出顯著的抗凝作用，因此在抗凝纖溶作用方面，選取仿生酶解提取法或水提醇沉法作為繼續研究對象更具有實驗價值。

［1］國家藥典編委會.中華人民共和國藥典［M］.2010版.北京:中國醫藥科技出版社，2010:256.

［2］劉善庭，李建美，王立贊，等.蟬蛻對大鼠血液流變學影響的實驗研究［J］.中醫藥學報，2004，32(3):56-59.

［3］王永梅，徐樹楠，張美玉，等.蟬蛻對哮喘大鼠模型支氣管和肺組織形態學及血清中TXB2和6-Keto-PGF1α的影響［J］.中藥藥理及臨床，2007，23(6):45-47.

［4］朱梅，李穎，薛紹杰.通心絡膠囊治療冠心病不穩定型心絞痛32例臨床觀察［J］.中國新醫藥，2003，(1):63-63.

［5］李濯冰，趙韶華，王玉蓉，等.水蛭不同工藝提取物抗凝與纖溶活性比較及酶解物組成分析［J］.中成藥，2011，33(1):42-45.

［6］徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實驗方法學［M］.3版.北京:人民衛生出版社，2001.

［7］李紹平，季暉，龔小健，等.血凝-纖溶動態圖在抗凝和溶栓藥效研究中的應用Ⅰ［J］.中國藥科大學學報，1996，27(12):743-747.