bcl-2、bax、caspase-3在細胞凋亡中的作用及其關系

董雅潔 高維娟 (承德醫學院病理生理學教研室，河北 承德 067000)

細胞凋亡是細胞在一定的生理或病理條件下，受多種基因精確調控的主動的、程序化的死亡過程，是機體重要的自穩調節機制〔1〕。近年來通過大量實驗研究表明，線粒體通路在細胞存亡機制中起著至關重要的作用，而在眾多的凋亡調控基因中，bcl-2蛋白家族和胱天蛋白酶(caspase)家族目前最受關注，其中bcl-2基因和bax基因是目前已知的在凋亡調控過程中功能相互對立的一對最重要的調控基因，caspase-3是凋亡過程中最關鍵的凋亡執行蛋白酶，三者在細胞凋亡過程中的關系已成為凋亡研究中的熱點問題，本文將就此做一綜述。

1 bcl-2蛋白與細胞凋亡

1.1 bcl-2蛋白家族的分類、結構與功能 bcl-2是B細胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia 2，bcl-2)的縮寫，與秀麗隱桿線蟲的生存基因Ced-9有高度同源性，是細胞凋亡信號轉導途徑中關鍵的凋亡調節因子。目前已發現有20余種bcl-2蛋白家族成員，這一多基因家族均由決定蛋白亞細胞定位的羧基端疏水性跨膜結構域(TM)和數量不等的bcl-2同源結構域所構成。根據其功能和結構的不同可將bcl-2基因家族分為三類：第一類是 bcl-2 亞家族，包括：bcl-2、bcl-xl、bcl-w、Mcl-l、bfl-1/A1和bcl-G等，它們一般均同時含有BH1～BH4四個同源結構域，其中BH4是抗凋亡蛋白所特有的結構域，決定著抑制細胞凋亡功能的存在〔2〕;第二類是Bax亞家族，包括：bax、bak等，其結構中一般都含有BH1、BH2和BH3三個結構域，可促進細胞的凋亡;第三類是促細胞凋亡蛋白中的特殊成員BH3亞家族，包括 bad、bid、bim、bik、Puma和 Noxa等，此亞家族最顯著的特點是僅含有一個BH3結構域，BH3結構域被認為是細胞凋亡所必需的致死性結構域，起促凋亡活性的發揮至關重要〔3〕。

1.1.1 bcl-2的結構及功能 抗凋亡基因代表成員bcl-2是第一個被確認的能對抗細胞凋亡的基因，與Ced-9基因同源性為23%，由239個氨基酸殘基所構成，定位于18號染色體21區，含3個外顯子和2個內含子，可編碼26 kD的bcl-2α和22 kD的bcl-2β兩種蛋白，其中bcl-2α是抑制凋亡作用發揮的主要蛋白，為線粒體膜的整合蛋白〔4〕。三維結構研究顯示，bcl-2是由位于中心的兩個長疏水性α-螺旋(α5和α6)包繞著外周五個親水性兩性α-螺旋構成的七螺旋拓撲結構。在其肽鏈的C末端具有由19個疏水性氨基酸片段組成的跨膜結構區域，可通過該疏水區錨定于線粒體外膜、外核膜及部分內質網膜表面，是阻止凋亡早期征象發生的重要區域〔5〕。

1.1.2 bax的結構及功能 bax作為促凋亡代表成員位于19q13.3～q13.4區，由6個外顯子和5個內含子組成，能夠編碼α、β、γ、δ、ε和σ6種bax蛋白亞型。多項實驗證明，bax基因編碼的具有生物學活性的baxα由192個氨基酸組成，分子量為21 kD，是bax基因在細胞中發揮促凋亡作用的主要表達形式。蛋白質序列分析顯示，baxα蛋白其21%的氨基酸與bcl-2具有同源性，且集中在C端的保守區。

1.2 bcl-2蛋白家族在細胞凋亡中的調控機制

1.2.1 bcl-2在細胞凋亡中的調控機制 定位于線粒體外膜上的bcl-2至少在三個水平上發揮凋亡抑制作用：(1)通過抑制谷胱甘肽的外泄、降低/對抗線粒體巰基的氧化還原狀態以控制其膜電位從而抑制細胞凋亡的發生;(2)通過介導線粒體外膜通透轉運孔(PT)孔道復合體的開放，抑制細胞色素c(cyt-c)和凋亡誘導因子AIF等促凋亡蛋白的釋放阻止凋亡的進程;(3)通過與胱冬肽酶的間接作用，將凋亡蛋白酶激活因子Apaf-1定位至線粒體膜，通過對其結構的調控阻斷凋亡蛋白酶的激活，組織cty-c作用的發揮，使細胞免于死亡〔6〕。

定位于內質網膜上的bcl-2抗細胞凋亡作用的發揮主要與胞內的Ca2+濃度高低有關〔7〕。在凋亡的早期，內質網中的Ca2+持續釋放，導致胞質中的Ca2+濃度持續增高可充當凋亡的啟動信號引發細胞凋亡〔8〕。Ling等〔9〕發現，高表達的 bcl-2可明顯抑制K+引起的Ca2+濃度升高，且這種抑制作用在加入bcl-2抑制劑后消失。應用轉基因方法發現，bcl-2高表達可抑制Ca2+從內質網向胞質中的跨膜流動，使Ca2+依賴性核酸內切酶活性降低，胞質中Ca2+濃度處于穩定水平，從而抑制細胞凋亡。

1.2.2 bax在細胞凋亡中的調控機制 bax蛋白多以非活性單體形式分布于胞質中，只有在接收到凋亡信號刺激被激活后，發生分子構想改變，移位并插入線粒體外膜后形成bax大孔道，破壞線粒體膜的完整性，并于bcl-2等抑制凋亡的蛋白對抗，阻止其抗凋亡作用的發揮〔10〕。

1.2.3 bcl-2、bax蛋白間的相互作用關系 高分辨三維結構研究顯示，bcl-2、bax蛋白中的BH1和BH2兩個同源結構域可形成一疏水凹槽，分別與其N端的α-螺旋(bcl-2為BH3、BH4螺旋，bax僅有BH3螺旋片段)通過靜電和疏水作用結合形成同源二聚體;而易位至線粒體外膜上的促凋亡蛋白bax表面暴露的BH3螺旋可與抗凋亡的bcl-2蛋白表面的疏水凹槽結合，形成異源二聚體〔11〕。特定的蛋白二聚體對細胞凋亡進程產生不同的影響，這是bcl-2蛋白家族在細胞死亡信號轉導調控過程中所特有的重要特征，是凋亡“主開關”作用發揮的重要結構域。研究發現，通常情況下bcl-2和bax兩種蛋白的表達量相對穩定，而當bax在細胞內超表達時，bax/bax同源二聚體的數量明顯增多，細胞對死亡信號的反應性增強，啟動凋亡;而當bcl-2高表達時，則bax/bax二聚體大量解離，生成更為穩定的bcl-2/bax異源二聚體，對抗其誘導凋亡的作用，使細胞存活期延長〔12〕。因此，多項研究〔13，14〕認為細胞內這兩種對立蛋白間的比率關系是決定細胞存亡的關鍵。

2 caspase蛋白與細胞凋亡

2.1 caspase蛋白家族的分類、結構與功能 caspase是一類存在于胞質中的半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶，與線蟲的自殺基因CED-3同源，在細胞凋亡的過程中起著極其關鍵性作用〔15〕。迄今在哺乳動物中已發現該蛋白家族有14個性質不同的成員，按發現的順序依次命名為caspase-1至caspase-14，其中至少有8個與細胞凋亡有關〔16〕。

根據在細胞凋亡過程中的結構和功能可將caspase蛋白酶分為三大類：第一類是炎癥有關亞類，包括 caspase-l、4、5、13、14及小鼠caspase-11、12，主要參與促炎因子的成熟，在細胞凋亡進程中起輔助作用;第二類是凋亡啟動亞類：包括caspase-2、8、9、10，這一亞類蛋白酶位于級聯反應上游，在結構上一般都具有較長的原結構域，能參與啟動下游的caspase蛋白酶〔17〕;第三類是凋亡效應亞類：包括caspase-3、6、7，位于級聯反應下游，一般分子相對較小，缺少蛋白質結合結構域，執行剪切細胞結構蛋白的作用，直接使細胞發生凋亡〔18〕。

caspase家族成員具有以下共同特點：①每個成員在催化位點上均含有一個特異性的五肽序列QACXG;②在胞漿內均以相對分子量為30～50 kD的無活性的酶原形式存在，一個N端前域(prodomain)及一個由大小兩個亞基構成的C端酶作用域;③酶活性依賴于半胱氨酸殘基的親核性;④對在底物N-末端裂解位點上的天門冬氨酸具有高度的特異性;⑤經蛋白水解激活后大小亞基解離重組形成異四聚體活性形式。⑥caspase可自我活化并能相互激活，凋亡過程一旦觸發，即以聯級放大的方式進行;⑦正常情況下細胞內caspase總是與其抑制劑共存，以免caspase酶原被意外激活而對正常細胞造成損傷。

2.2 caspase-3在細胞凋亡中的作用機制 凋亡發生是一個由caspase家族成員介導的蛋白酶級聯反應過程，即caspases在凋亡誘導信號的作用下，啟動型caspases先通過結合特異輔因子而激活，發揮水解蛋白的作用，從而激活下游效應型caspases，一旦效應caspase被激活，便大范圍的水解細胞內的靶物質，從而降解細胞內蛋白，最終使細胞不可逆的走向死亡〔19〕。caspase-3是ICE(白細胞介素1-β轉化酶)家族成員之一，又稱為半胱氨酸蛋白酶32(CPP32)，與Ced-3同源性最高，是主要的效應caspase，是多種凋亡途徑的共同下游效應部分，在細胞凋亡過程中占據核心地位，被稱為“死亡執行蛋白酶”〔20〕。其主要受粒酶 B、caspase-l、caspase-2、caspase-10、CPP32 激活蛋白酶(CAP)以及自身等所活化，活化后的caspase-3酶解切割DNA-PK(DNA依賴的蛋白激酶)和PARP(聚腺苷二磷酸核糖多聚酶)等，從而影響DNA復制、轉錄和損傷修復〔21〕。

3 bcl-2、bax和caspase-3在細胞凋亡中的相互關系

細胞凋亡的發生和發展可以概括為凋亡誘導、調控執行和效應三個階段，現已證明至少有線粒體途徑、死亡受體途徑和內質網途徑三條通路參與凋亡的發生〔22〕。其中線粒體依賴途徑是主要的傳導途徑，JNK通路是主要信號轉導通路，cyt-c是線粒體電子電子傳遞鏈上的一個重要組成部分，其從線粒體釋放是凋亡啟動的關鍵步驟〔23〕。caspase-3作為caspase級聯反應下游最關鍵的凋亡執行者，其激活在很大程度上依賴于cyt-c的釋放，而bcl-2家族中的bcl-2、bax基因是目前已知的細胞凋亡中最重要的調控基因，可通過線粒體途徑介導cyt-c等物質釋放。隨著近年來關于bcl-2、bax和caspase-3在細胞凋亡信號傳導過程中關系研究的進一步深入，發現bcl-2、bax不但可作為caspase-3的上游調控機制，參與對 caspase-3活性的調節〔24〕，還可作為 caspase-3的直接底物作用于 caspase-3的下游，二者在細胞凋亡傳導過程中既相互聯系又相互制約。

3.1 bcl-2、bax可作為caspase-3的上游調控機制 bcl-2、bax蛋白位于線粒體上游，是線粒體膜的通透性改變的重要調控因素〔25〕，其過度表達能控制cyt-c的釋放和下游caspase-3蛋白酶的活化，介導細胞的存活或死亡〔26〕。bax在死亡信號刺激下可轉位至線粒體膜上，形成同源二聚體或多聚體，并在線粒體膜上形成通透性PT孔道，破壞膜內離子及蛋白濃度差，釋放出cyt-c等促凋亡因子〔27〕。在dATP存在下cyt-c通過半胱氨酸蛋白酶作用域與Apaf-1結合形成凋亡體，并招募procaspase-9在其上寡聚〔28〕，進而激活 caspase-3，啟動 caspase 級聯反應〔29〕。超表達的bcl-2蛋白一方面可與bax形成異源二聚體，抑制bax的轉位及二聚體化，關閉PT孔道，通過阻斷cyt-c的釋放，抑制下游caspase-3的激活，而有效地抑制細胞凋亡的發生〔30〕。另一方面，bcl-2還能與 Apaf-1結合并抑制其功能，阻止 procaspase-9活化實現抗凋亡的效應〔11〕。此外，有研究發現bcl-2的過度表達可引起細胞核谷胱甘肽積聚，導致核內氧化還原平衡的改變，阻止胞內Ca2+流動，抑制線粒體膜釋放cyt-c，從而抑制caspase-3的活化，阻斷凋亡進程。

3.2 caspase-3可作為bcl-2的上游調控機制 bcl-2可作為caspase-3的直接作用底物，bcl-2蛋白的N端可變環區可被caspase-3在Asp34處剪切，裂解為具有類bax促凋亡活性功能的片段，加速凋亡進程。這一步驟被證明是凋亡信號轉導最關鍵限速步驟之一〔31〕。Kirsch等〔31〕用細胞凋亡提取物誘發細胞凋亡時，可見bcl-2的剪切片段。在對提取物進行caspase-3免疫清除后，bcl-2則不被剪切。當用stau-rosporine(一種癌基因抑活藥)誘導缺乏caspase-3表達的MCF-7細胞凋亡時，bcl-2也不被剪切，由此說明caspase-3是bcl-2的生理性酶解蛋白酶，可構成陽性凋亡反饋通路。

4 結語

大量研究顯示，bcl-2家族和caspase家族在細胞凋亡轉導通路尤其是線粒體途徑中發揮了極為重要的調控作用。然而，對bcl-2、bax和caspase-3蛋白的認識還有待更進一步深入，目前，有關于caspase-3抑制劑、bcl-2及bax的激動劑和拮抗劑的研究也日益受到關注，這將有助于進一步明確二者在在細胞凋亡過程中的相互關系，揭示細胞凋亡的復雜的分子機制，并可能為凋亡相關疾病的治療提供新的作用靶點，為設計出更有效的治療手段提供重要的理論依據。

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