優化單純皰疹病毒DNA疫苗的研究進展

夏 利 程培華 (桂林醫學院附屬醫院皮膚科，廣西 桂林 541001)

優化單純皰疹病毒DNA疫苗的研究進展

夏 利 程培華 (桂林醫學院附屬醫院皮膚科，廣西 桂林 541001)

單純皰疹病毒;HSV-DNA疫苗;生殖器皰疹

單純皰疹病毒(HSV)是生殖器皰疹(GH)的主要病原體，主要通過性接觸傳播。HSV感染機體后可長期潛伏在骶神經節中，逃避宿主免疫系統的識別，因而無法徹底清除。在一定條件如應激、疲勞、免疫力低下等情況下，潛伏病毒被激活而發病，其復發率可高達80%。GH易復發、不易治愈的傾向與患者免疫功能紊亂有關，抗病毒聯合免疫治療雖然取得了明顯療效，但是不能有效預防HSV感染，控制潛伏，減少復發。另外，其服藥時間長，停藥后易復發，加重了患者的經濟負擔，目前沒有能夠控制其復發的特效藥。研制有效的HSV-DNA疫苗成為防治HSV感染的理想方法。如何優化HSV-DNA疫苗，國內外學者進行了大量的實驗研究，并取得了一定進展，但目前仍無一種人用HSV-DNA疫苗面世。本文對近年來優化HSV-DNA疫苗的研究進展做一綜述。

1 HSV-DNA疫苗簡介

DNA疫苗是伴隨現代分子生物學技術的發展而發展起來的新型疫苗，是繼第一代減毒活疫苗和第二代亞單位疫苗之后的第三代新型疫苗。DNA疫苗是將編碼某種蛋白的外源基因片段克隆到真核表達質粒，再用該DNA免疫動物，抗原編碼基因能夠在宿主體內表達，并刺激產生針對該抗原蛋白的體液免疫和細胞免疫，以達到預防和治療疾病的目的。引入的外源基因可以在體內長期存在，并不斷表達外源蛋白，持續的刺激機體免疫系統，因此，微量的DNA疫苗即可刺激產生強而持久的免疫應答。HSV感染是一個極其復雜的過程，機體的體液免疫、細胞免疫和黏膜免疫共同參與防御。HSV-DNA疫苗能高效、穩定誘導細胞毒性T淋巴(CTL)效應，并且可以共表達免疫調節因子，根據需要誘導產生最適免疫應答，較其他疫苗更有優勢，且安全性更高。加之DNA的易操作性，使HSV-DNA疫苗備受青睞。

包膜糖蛋白參與HSV病毒吸附、入胞、融合、出胞等全過程，是GH發病的關鍵所在。在已知的11種包膜糖蛋白中，糖蛋白D(Gly coprotein D，gD)是高度保守的蛋白，與其他亞群同源性高，具有同種異株的交叉保護作用。同時gD具有較強的免疫原性，是產生中和抗體的主要糖蛋白，能誘導特異抗HSV抗體產生及活性增強，抑制和中和HSV，從而控制復發。gD是特異性CTL識別位點，可誘導強大的CTL效應。gD具有與天然抗原相同的構象和抗原性，可誘導機體產生全面的免疫應答，因此 HSV-DNA疫苗是目前研究熱點。Cooper等〔1〕認為HSV-2gD是制備HSV-DNA疫苗的最佳選擇。gD-DNA疫苗免疫豚鼠可產生高滴度的中和抗體，使HSV失活，減少HSV形成潛伏感染的機會，從而有效降低其復發率。

近年來人們開始關注早期表達蛋白(ICP)，并將其作為候選蛋白。Haynes等〔2〕通過HSV-2 ICP27聯合大腸桿菌耐熱腸毒素(LT)，共免疫小鼠并進行攻擊試驗，發現可誘導出ICP27特異性免疫反應，并可使小鼠免受致死量HSV-2的攻擊。

HSV-DNA疫苗因具有多種優點而備受關注，各種新型HSV-DNA疫苗已經成功構建，并且免疫動物效果也很明顯，但其臨床試驗效果并不如意。國內外學者致力于尋找其原因，并探求優化HSV-DNA疫苗，已取得一定進展。

2 增強疫苗免疫原性

2.1 免疫佐劑 某些物質若先于抗原或與抗原一起注入機體，可增強機體對該抗原的特異性免疫應答，此類物質稱為免疫佐劑。將一些編碼細胞因子的質粒，如IL-2、IL-12、IL-18、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSFL)等與DNA疫苗共同轉錄后可起到免疫佐劑作用，其被體內細胞攝取后表達的免疫刺激因子能夠較長時間刺激免疫活性細胞，大大強化了gD蛋白誘導的體液免疫和細胞免疫。

Th1細胞在機體抗HSV胞內感染中發揮重要作用。微環境中細胞因子的種類是影響Th細胞分化的關鍵因素。在諸多的細胞因子中，IL-12起關鍵作用，有利于Th0向Th1細胞分化。IL-12可能成為最重要的免疫佐劑。Sin等〔3〕用編碼HSV-2gD的質粒與編碼IL-12P40和IL-12P35的質粒共注射免疫小鼠，結果發現可誘導出高水平的IgA、IgG和IgE，體液免疫明顯增強，同時T細胞增殖實驗表明，細胞免疫也明顯增強，共注射可顯著提高刺激指數。

2.2 CTL表位 以CTL為主的細胞免疫是抗HSV感染的重要組成部分。CTL表位可誘導有效CTL效應，中和HSV顆粒，直接殺傷感染靶細胞，成為特異性細胞免疫重要效應細胞之一。因而，CTL為主的細胞免疫作為優勢應答逐漸受到重視。

CTL表位是內源性抗原經APC加工、由MHC分子提呈給TCR的短肽，是介導細胞免疫應答的關鍵部位，能誘導機體產生強烈的細胞免疫應答，同時也能誘導體液免疫應答〔4〕。楊慧蘭等〔5〕構建的pVAX-gD-CTL添加了特異CTL表位基因，并在小鼠體內成功激活出有效的CTL效應，其研究結果表明gD CTL表位的加入明顯提高了CTL的活性，促進小鼠Th1介導的細胞免疫應答。

2.3 截短糖蛋白 具有高度免疫原性的HSV-gD-DNA疫苗已經成功構建，并且形成了有效的免疫保護作用，但其臨床試驗卻不足以抵御HSV感染而宣告失敗。分析其原因可能是由于gD基因較大(共1 182 bp，編碼393個aa)，將其融合到真核表達載體，在體內表達的過程中可能會失去某些抗原表位。為增強HSV疫苗的抗原性，學者們試著去除部分功能性的胞內區和跨膜區的編碼基因，同時，在不改變其編碼蛋白免疫原性的基礎上，盡量對其胞外區進行截短。特別是在目前尚未徹底明確完整抗原蛋白是否對宿主具有毒性或免疫抑制作用的情況下，對抗原進行截短尤為重要。

馮非等〔6〕對完整的gB進行剪切，從HSV SM44株基因組中擴增出HSV-gBt編碼基因，其含有去除了部分N基端的信號肽序列和部分胞外區基因組序列，把該目的基因插入到真核表達載體pcDNA3中，成功構建出重組質粒pcDNA3-gBt。截短的糖蛋白已被證實具有明顯的免疫效果。

2.4 模擬抗原表位 隨著噬菌體隨機肽庫展示技術的誕生，學者們開始試著模擬gD的抗原表位，并試圖將其作為新型的候選抗原。于愛蓮等〔7〕從噬菌體隨機肽庫中篩選針對HSVgD單克隆抗體的基因，在11個陽性克隆序列中，有9條含有2個同源性較高的氨基酸序列，即PYH-H和P-PLW，認為這2個氨基酸核心骨架可能是HSVgD的模擬抗原表位。抗原表位有線型構象和模擬表位兩種，利用針對HSV-2gD的單克隆抗體(McAb)從隨機肽庫中篩選出相應的模擬抗原表位骨架序列。

這些模擬抗原表位不需要預先確定抗原蛋白質的氨基酸序列〔8〕。但其免疫原性及其誘導抗體產生的免疫保護效應還有待進一步驗證。若能找到基因序列短，免疫原性高的替代抗原，則可謂之找到了一個新型有效的候選抗原。將多個模擬抗原表位同時克隆在同一載體中構建多表位復合疫苗，將為HSV-DNA疫苗提供更有效更廣闊的發展前景。

2.5 多表位復合疫苗 將多個抗原基因導入同一載體中構建多表位復合疫苗，可大大增強疫苗的免疫原性，從而誘導出強大的免疫保護作用。對HSV的抗原性及抗原表位的深入研究，使多表位復合疫苗成為可能。Domingo等〔9〕對gD和gB復合疫苗的研究結果表明，gD/gB共同免疫刺激機體產生的保護效果要優于單一糖蛋白免疫的效果。單一抗原表位疫苗用于防治HSV感染具有一定的局限性，多表位復合疫苗可能是最為理想的疫苗。

徐金華等〔10〕將 HSV-2疫苗的主要候選糖蛋白 gD、gB、gC和早期表達蛋白ICP27基因融合，成功構建了HSV-2多表位復合疫苗，用其免疫小鼠可誘導產生HSV-2特異性IgG和IFN-γ，且CTL活性增強。

3 增強機體反應性

3.1 接種方式 在影響DNA疫苗免疫效果的諸多因素中，接種方式起著關鍵作用。DNA疫苗通常首選肌肉注射，由于肌肉組織是分化的終末細胞，將外源DNA整合到細胞基因組DNA的可能性很小，故該途徑免疫效果不佳。HSV-DNA疫苗接種效率還有待提高。為增強疫苗的導入效率及其隨后誘導的免疫效應，學者們試圖用各種接種途徑來探究其免疫誘導效應。

有科學家用HSV-2gD經不同途徑免疫豚鼠，比較發現陰道內接種對豚鼠的免疫保護作用最強〔11〕。徐金華等〔10〕研究結果表明用脂質體包裹質粒比裸質粒肌肉注射免疫小鼠能顯著提高其免疫活性。Jazayeri等〔12〕報道，經足底皮下注射(pcDNA3-gD2)免疫小鼠較肌肉注射的免疫效果更好。HSV-DNA疫苗免疫接種途徑較靈活，目前尚未達到統一。

3.2 表達載體 DNA疫苗是病原體的保護性抗原基因和載體的重組質粒。HSV-DNA疫苗的研究不斷有新突破，國內外學者也分別成功構建了不同表達載體的重組質粒。PcDNA3.1具有真核啟動子pcmv，能夠高水平表達下游蛋白，是構建DNA疫苗常用的表達載體。在此基礎上，Invitrogen公司成功研制了真核表達質粒pVAX1。不僅能高水平表達目的基因，同時還含有卡那霉素抗性基因的特性，目前已經廣泛用于DNA疫苗研制。但目前為止世界上仍沒有一種合適于人用的HSV-DNA疫苗，因為目前構建DNA疫苗的載體質粒通常含有氨芐青霉素抗性基因，其副作用較大，不符合人用DNA疫苗載體的安全標準。何方等〔13〕已成功去除了真核表達質粒載體pcDNA3中的氨芐青霉素抗性基因，構建了含Kan抗性的真核表達質粒載體pcDNAKan，為新型HSV-DNA疫苗的構建奠定了基礎。

3.3 聯合免疫 國內外學者正在探索新的DNA疫苗方法，如DNA疫苗聯合免疫，核酸/蛋白的聯合免疫等。Fotouhi等〔14〕用pcDNA3-gD2免疫小鼠，再有gD2蛋白加強免疫一次，結果顯示聯合免疫效果比單獨用DNA疫苗或蛋白疫苗免疫兩次要顯著增強。

安全性分析將外源性抗原重組質粒DNA整合到宿主細胞DNA中，首先要考慮的一個重要問題是安全性。于芳等〔15〕用不同劑量pcDNA3-gB(100，300，500 mg/L)免疫小鼠后，分別檢測各組小鼠的血液生理學，血液生化學指標以及8個重要組織器官的病理學(心、肝、脾、肺、腎、角膜、腦和三叉神經節)，結果各項指標均無明顯變化，與對照組(生理鹽水組)相比無顯著性差異，初步說明pcDNA3-Gb是安全的。

4 展望

HSV感染激發的細胞免疫應答傾斜漂移于Th2介導的體液免疫，即發生了免疫逃避，使得HSV病毒不能有效清除，從而潛伏于神經節。Th1/Th2平衡失調越嚴重，GH患者復發就越頻繁。因此能否有效誘導Th1型免疫應答是評價HSV-DNA疫苗效果的重要指標。優化HSV-DNA疫苗的最終目標是誘導機體產生高水平的Th1型細胞免疫，同時應增加T細胞庫中特異性CTL細胞的數量。多表位復合DNA疫苗有很好的應用前景。無論是DNA疫苗本身還是免疫佐劑，其免疫效應都隨著免疫途徑和劑量的不同而不同，這些將有待進一步研究和改進。一旦明確其影響效應，將有助于DNA疫苗的優化，增強其實用性。同時也要考慮HSV-DNA疫苗是否存在免疫耐受、基因突變、非目的基因編碼蛋白的副作用。

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2 Haynes JR，Arrington I，Dong L，et al.Potent protective cellular immune responses generated by a DNA vaccine ending HSV-2 ICP27 and E.coli heat labile enterotoxin〔J〕.Vaccine，2006;24(23)：5016-26.

3 Sin JI，Kim JJ，Boyer JD，et al.In vivo modulation of vaccine-induced immune responses toward a 7 h phenotype micreasea potency and vaccine effectiveness in a herpes simplex virus type 2 mouse model〔J〕.J Virol，1999;73(1)：501-9.

4 Van Hall T，Laban S，Koppers-Lalic D，et al.The varicellovirus-encoded TAP inhibitor UL 49.5 regulates the presentation of CTL epitopes by Qalbl〔J〕.J Immunol，2007;178(2)：657-62.

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7 于愛蓮，焦鳳萍，王 玉.用噬菌體隨機12肽庫篩選單純皰疹病毒Ⅱ型gD基因模擬抗原表位的研究〔J〕.中國現代醫學雜志，2008;18(9)：1194-6.

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9 Domingo C，Gadea I，Pardeiro M，et al.Immunological properties of a DNA plasmid encoding a chimeric protein of herpes simplex virus type 2 glycoprotein B and glycoprotein D〔J〕.Vaccine，2003;21(25-26)：3565-94.

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R373

A

1005-9202(2012)06-1317-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.06.109

廣西自然科學基金(2010GXNSFA013249)

程培華(1959-)，男，主任醫師，教授，主要從事皮膚病毒性及真菌性疾病研究。

夏 利(1986-)，女，碩士，主要從事皮膚病毒性及真菌性疾病研究。

〔2011-03-30收稿 2011-09-21修回〕

(編輯 張 慧)