來氟米特代謝物teriflunomide調節NFATc1基因抑制破骨細胞分化作用研究*

姚 瑤，丁從珠，葛衛紅**

南京大學醫學院附屬鼓樓醫院1藥學部；2風濕免疫科，南京 210008

類風濕關節炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一種臨床常見的以侵犯滑膜關節為主要特征的自身免疫性疾病，其發病機制復雜，病變過程涉及多種細胞[1]。研究表明，破骨細胞的活化是引起類風濕性關節炎骨破壞的關鍵[2]。來氟米特是一種免疫調節劑，在體內代謝為有活性的物質teriflunomide[3]（圖1），臨床用于緩解類風濕性關節炎病人炎癥[4]。前期研究表明，來氟米特也能夠抑制類風濕性關節炎引起的骨破壞。本實驗研究來氟米特活性代謝物teriflunomide對人外周血單核細胞向破骨細胞分化的調節作用，從而探討來氟米特對抗類風濕性關節炎骨破壞的作用機制。

圖1 來氟米特及其活性代謝物結構式和生物轉化

1 材料與試劑

Teriflunomide（蘇州長征-欣凱制藥有限公司，純度為99.7%）；青藤堿標準品（中國藥品生物制品檢定所，純度為99.8%）；改良型α-MEM培養液（Thermo公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程有限公司）；淋巴細胞分離液（天津市TBD生物技術發展中心）；重組人源巨噬細胞集落刺激因子 （MCSF）、細胞核因子kB受體活化因子配基（RANKL，Peprotech公司）；TRAP染色試劑盒 （美國Sigma公司）；TRIzol（美國Invitrogen公司）；SYBR Premix試劑盒、引物（大連TaKaRa公司）。

2 方 法

2.1 健康人外周血單個核細胞（PBMC）的制備

安靜狀態下抽取靜脈血用等量磷酸緩沖液（PBS）稀釋混勻，將稀釋的外周血沿管壁緩慢加至等體積的淋巴細胞分離液上面，保持兩者界面清晰。水平離心機以2000 r·min-1常溫離心20 min，吸出中間灰白色PBMC層至另一離心管，用10～15 mL PBS洗滌兩次，依次以1500、1000 r·min-1轉速離心10 min，吸棄上清。用含有15%胎牛血清的α-MEM培養液重懸細胞。

2.2 MTT法檢測藥物對細胞增殖的作用

將上述重懸的PBMC平均接種在96孔培養板中，調整細胞濃度為5×105/mL，每孔接種100 μL，加入M-CSF（20 ng·mL-1）培養24 h。后用不同濃度teriflunomide（1000、100、10 μmol·L-1）以及青藤堿1000 μmol·L-1（陽性對照）干預，以未加藥物組作為空白對照組。繼續培養48 h后每孔加入5 mg·mL-1噻唑藍（MTT）20 μL，在37℃條件下繼續孵育4 h后吸棄培養基，每孔加入150 μL二甲亞砜（DMSO），室溫振蕩10 min使結晶物充分溶解，在酶標儀上測定570 nm波長處各孔的吸光度（OD）值，以每組3個孔的均值作為結果。

2.3 RANKL誘導破骨細胞

與上同法。將PBMC平均接種在96孔培養板中，調整細胞濃度為5×105/mL，每孔接種100 μL RANKL（60 ng·mL-1）和M-CSF（20 ng·mL-1）誘導分化。用不同濃度的teriflunomide（1000、100、10 μmol· L-1）干預，以未加藥物組作為對照組。每3天換液一次，第15天終止培養，行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色；隨機選取3個鏡下視野（100倍，高倍鏡視野20×20），計數TRAP陽性多核破骨細胞（≥2個核），取平均數，并留取細胞上清液。

2.4 NFATc1信號分子表達檢測

調整細胞濃度為5×105/mL，每孔接種1000 μL，將PBMC平均接種在6孔培養板中，RANKL（60 ng·mL-1）和M-CSF（20 ng·mL-1）誘導分化。分別加入teriflunomide（1000、100、10 μmol·L-1）干預，以未加藥物組作為對照組。37℃、5%CO2孵箱常規培養24 h。將上述分組處理后的細胞懸液移至環氧樹脂（EP）管中，2000 r·min-1離心10 min。沉淀的細胞加入1 mL TRIzol抽提RNA，按試劑盒操作進行逆轉錄。逆轉錄結束后，收集cDNA樣品并以相應的cDNA為模板進行 PCR擴增。冰浴溶化 SYBR Premix real-time PCR試劑，再將cDNA濃度調整在0.5 μg·μL-1左右。PCR反應體系總體積20 μL，在ABI Prism7500型高通量熒光定量PCR儀上進行實時熒光定量PCR，見表1。各基因每個標本做3個復孔。擴增條件：第一步（預變性），95℃ 30 s，1個循環；第二步（PCR反應）95℃ 5 s，60℃ 34 s，各40個循環。

表1 實時熒光定量PCR（polymerase chain reaction）引物序列

2.5 統計學處理

實驗結果采用SPSS 16.0統計分析軟件以及單因素方差分析數據，檢測各組之間是否存在差異，P＜0.05為具有統計學差異。

3 結 果

3.1 不同加藥組對PBMC增殖的影響

由表2可見，MTT結果顯示不同濃度的teriflunomide（1000、100、10 μmol·L-1）以及陽性對照青藤堿處理細胞48 h后，細胞的增殖的情況，結果顯示組間無差異（P＞0.05）。

表2 不同加藥組對PBMC增殖的影響，n=3）

表2 不同加藥組對PBMC增殖的影響，n=3）

注：a與對照組比較P＞0.05

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3.2 Teriflunomide對破骨細胞分化的干預

細胞培養15天后行TRAP染色，細胞胞質紅褐色，胞核藍染，體積明顯增大，形態不規則，多核，以2～3個核為主 （見圖2）。藥物處理誘導分化的PBMC，各加藥組對破骨細胞（OC）的分化均有不同程度的抑制作用，15天后抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色后顯微鏡下觀察分化成熟的OC數目，結果顯示teriflunomide隨著濃度的增加，對OC分化的抑制作用越顯著（P＜0.05），見表3。

圖2 顯微鏡下PMBC（A）以及TRAP染色破骨細胞（B）清晰可見多核

3.3 Teriflunomide對破骨細胞分化信號分子NFATc1表達的調控

根據儀器測定各樣品Ct值，計算各平均Ct值，以GAPDH作為內參，將目標基因Ct值減去GAPDH的Ct值，得△Ct值。計算標準化后的2—ΔΔCt值表示mRNA的相對表達含量，見表4。結果顯示，給藥24 h后，1000 μmol·L-1teriflunomide能夠有效下調PBMC中的NFATc1 mRNA表達（P＜0.05），其相對表達量為0.74，與陽性對照青藤堿無顯著差異（P＞0.05）。

表3 不同加藥組TRAP（+）OC數（n=3）

表4 不同加藥組對NFATc1表達的影響（n=3）

4 討 論

來氟米特臨床用于治療類風濕性關節炎，無論是單獨使用還是與其他藥物合用均能發揮強大的免疫抑制作用，且不良反應較少[5]。作用機理是通過抑制二氫乳清酸脫氫酶的活性而抑制嘧啶的從頭合成途徑，抑制酪酸激酶活性而抑制細胞激活時的信號轉導。

Oh[6]的最新研究表明，teriflunomide能夠顯著抑制T細胞的增殖及其炎癥因子的分泌。T細胞分泌的大量的炎癥因子如TNF、IL-17等能夠引起RA患者的滑膜炎，誘導滑膜組織增生。繼而有研究表明，teriflunomide也能抑制RA患者滑膜細胞諸如RANKL、金屬蛋白酶（MMPs）等的細胞因子分泌[7]，我們的前期研究也證實了這一觀點。同時，最新研究證明teriflunomide不能促進Treg細胞的增殖，提示teriflunomide產生免疫抑制作用主要還是通過對T細胞和滑膜細胞的抑制[8]。研究表明，teriflunomide能夠抑制活化的THP-1細胞表面CD147、MMP-2、MMP-9的表達[9]。RANKL作為重要的破骨細胞因子，來源于T細胞以及滑膜細胞，直接決定破骨細胞的分化，而MMPs是引起軟骨和骨破壞的關鍵。在類風濕性關節炎環境下，炎癥細胞分泌的趨化因子能夠將外周血中單核細胞聚集到關節處，活化的T細胞以及異常增生的滑膜細胞分泌的大量的IL-1、IL-17以及RANKL等激活破骨細胞活化的重要轉錄因子NFATc1，從而使得PBMC分化為成熟的多核的破骨細胞，這些破骨細胞又能夠附著在骨組織上，并分泌出MMPs，破壞軟骨和骨組織，提示teriflunomide可能通過間接作用抑制RA患者的骨破壞[10]。

本研究以破骨細胞前體細胞PBMC為研究對象，研究來氟米特代謝物teriflunomide對PBMC增殖、RANKL誘導的分化以及分化過程中重要轉錄因子NFATc1表達的影響，探討teriflunomide對破骨細胞前體細胞是否有著直接的作用。本課題組已證實青藤堿能夠通過有效抑制NFATc1基因的表達，從而抑制破骨細胞的分化，因此，本研究以青藤堿為陽性對照。TRAP染色結果證實其能夠有效抑制PBMC向多核OC分化，Real-time PCR結果則顯示teriflunomide對OC分化的抑制作用可能是通過有效抑制NFATc1基因的表達，而MTT結果說明，teriflunomide并不能影響正常PBMC的增殖。提示 teriflunomide能夠 直接 阻斷 RANKL激 活NFATc1的通路，抑制骨破壞的作用，且對正常PBMC的功能并無特殊影響。這一點與Kobayashi[11]的研究結果相符。

綜上所述，teriflunomide既可以通過調劑免疫，減緩炎癥，抑制RA引起的骨破壞，同時也能夠直接作用于破骨細胞前體細胞，通過調節NFATc1基因的表達直接抑制其分化，進一步緩解骨破壞的進程。因此，類風濕性關節炎伴骨破壞患者，應推薦來氟米特治療。

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