靶向結締組織生長因子的siRNA對于肝星狀細胞介導肝纖維化的研究進展

樊雪強 陳新華 齊曉艷

1.內蒙古醫科大學，內蒙古呼和浩特 010110；2.呼和浩特市第二醫院肝病科，內蒙古呼和浩特 010031；3.內蒙古醫科大學附屬人民醫院消化內科，內蒙古呼和浩特 010010

肝纖維化是在多種細胞因子如靶向結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）等作用下、各種慢性肝病進展至肝硬化的共同通路。在此過程中，肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSC）活化并分泌細胞外基質（extracellular matrix，ECM）為重要病理生理基礎。因此，減少HSC活化、促進ECM降解可逆轉肝纖維化。有研究表明，siRNA靶向干擾HSC的CTGF基因表達為肝纖維化治療開辟了新的途徑。現將HSC、CTGF及siRNA與肝纖維化的研究進展綜述如下：

1 HSC

1.1 HSC概念及作用

對HSC的研究已有100 多年的歷史。1876年德國學者Kupffer首先用氯化金染色確認出HSC，稱之為sternzellen，1971年Wake再次應用氯化金染色證明Ito細胞即Kupffer所說的sternzellen[1]。HSC是功能多樣的肝內非實質細胞，故被命名為Ito細胞、貯脂細胞、竇周細胞、脂細胞、間質細胞或維生素A儲存細胞等[2]。

HSC大小介于肝細胞與庫普弗細胞（kupffer cell，KC）之間，中央帶較少，大多數排列于肝小葉的周圍，主要特點為形態不規則，胞體常延伸出形態各異的胞突包繞肝血竇，鄰近的HSC主要也是由延伸出的胞突相連接[3]。正常肝臟肝星狀細胞占肝內細胞總數的5%～15%，其主要功能是儲存維生素A、合成和分泌多種膠原酶和少量的ECM、釋放轉移生長因子 β （transfer growth factor-β，TGF-β） 及肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF），并參與肝臟的物質代謝[4]。 由于其細胞形態的可塑性及在立體空間的分布使其在調節肝血竇血流方面發揮重要作用[5]。

1.2 HSC活化

HSC活化是肝纖維化的病理變化中的重要事件[6-7]。在各種因素的刺激下，靜止的HSC活化、產生形態變化，由富含維生素A的狀態脫顆粒釋放出維生素A，這一過程稱為HSC的活化[4]。活化包括啟動及持續兩個階段。前者指早期在基因表達改變及細胞因子等刺激作用下細胞表型發生改變，由旁分泌機制參與；后者則是這些刺激因素維持HSC的活化表型，導致肝纖維化形成，既有旁分泌機制參與又有自分泌機制參與[8]。在啟動激活階段，在肝臟受到損傷后，HSC附近細胞如肝細胞、血小板、Kupffer細胞、血管內皮細胞、浸潤癌細胞等在旁分泌機制的作用參與下，釋放出一系列細胞因子，從而完成激活。活化的HSC具有以下生物學特征：①形態類似肌纖維母細胞；②增殖活性明顯增強；③胞質中脂滴、維生素A減少或消失；④表達a-SMA（a-smooth muscle actin，a-SMA）、波形蛋白及結合蛋白等；⑤分泌ECM增加；⑥基質金屬蛋白酶組織抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP）合成和分泌增加；⑦收縮性增強等。大多數研究顯示，活化HSC主要以凋亡的方式消除，此為肝纖維化消退的主要機制[4]。

1.3 HSC與肝纖維化

肝纖維化是一種以ECM沉積為特點的可逆的肝損傷修復反應[9]。在受損肝臟中，HSC是ECM的主要來源[10]。隨著各種因素進一步作用在肝臟，激活的HSC由復雜的旁分泌與自分泌作用合成并分泌ECM，大量的基質金屬蛋白酶抑制劑抑制膠原酶、明膠酶等合成、釋放，ECM降解速率下降使ECM降解小于合成，最終導致ECM在肝內過度積聚形成肝纖維化[11]。但器官纖維化分子機制由于其復雜性尚未全面闡明[12]。近年來研究表明，肝細胞在急性和慢性肝損傷時所分泌表達的 Smad（solvent metal atoms scattered）亞型不同，導致 HSC在活化之后出現表型及功能的不同，此研究在某種程度上詮釋了在慢性肝病時肝臟中有不溶性ECM沉積導致肝纖維化甚至肝硬化的原因[13-14]。

2 靶向CTGF siRNA對肝纖維化的影響

在分子水平，肝纖維化過程由多種生長因子、細胞因子及金屬細胞因子驅使[15]。細胞因子是一種具有多種細胞調節功能、高活性的蛋白多肽分子，由成纖維細胞、免疫細胞和內皮細胞產生，能夠對HSC增殖分化及ECM的合成產生影響，分為刺激因子和抑制因子兩大類。

CTGF是一種非結構性基質蛋白，能直接介導HSC活化、合成及分泌ECM[16-17]。在肝臟，CTGF是最受關注的CCN蛋白，它是TGF-β活化的關鍵調節器并通過觸發ECM的合成、重建參與肝損傷的起始和持續過程[18]。CTGF和ECM可協同作用并且促進細胞遷移、粘連、有絲分裂、生存及血管生成[19-20]。在組織肝纖維化過程中，CTGF主要涉及以下生物效能：具有有絲分裂原作用，促血管平滑肌細胞增殖；與其他細胞因子協同刺激ECM，抑制其降解、導致ECM的積累和結構重建；介導細胞的黏附過程；促進細胞趨化，在體外可趨化成纖維細胞。

研究表明，硬化組織的CTGF、TGF-β水平較正常組織表達增加6～8 倍，且此二者上升的水平與肝硬化發生、發展水平呈正相關。CTGF是TGF-β的下游效應介質，具有介導TGF-β促進ECM效應之作用。在白蛋白的控制下轉基因小鼠CTGF表達基因啟動子顯示在慢性CCl4干預下肝纖維化水平加劇[21]。各種體液（血清、血漿及尿液）中CTGF的測定已被用來評估纖維化的嚴重程度及重構的過程。Kovalenko等[22]開發了一種新型檢測CTGF人血清三明治ELISA法以求驗證CTGF作為非侵入性標志物的評估肝纖維形成的特殊過程和炎癥活動水平，并確認與健康組對照，肝纖維化患者血清CTGF水平顯著升高。HSC激活后可產生CTGF；反之，CTGF又促進成纖維細胞增殖、遷移、黏附和ECM的產生，誘導纖維化的產生。研究證實，CTGF對HSC產生的ECM有調節作用，并能促進HSC的遷移、增殖進而促使HSC活化。

siRNA是一種基因沉默的強大工具[23]。siRNA介導的同源基因沉默高效且針對性強，能夠抑制同源基因表達，從而降低了相應蛋白質水平和功能。先前的研究展示siRNA序列和劑量依賴TGF-β1基因沉默抑制相應的膠原蛋白合成[24]。

Li等[25]研究CTGF對于肝纖維化指標表達的影響。其結果顯示，siRNA能顯著抑制原代 HSC激活并下調原代大鼠HSC表達CTGF基因的水平。李光明等[26]在CCl4誘導的肝纖維化模型大鼠的門靜脈注入CTGF siRNA，觀察其抗纖維化作用以及對積聚ECM的影響。其研究結果顯示，沉默CTGF對大鼠肝組織中Ⅳ型膠原、層黏連蛋白mRNA表達增加及外周血透明質酸、Ⅴ型前膠原含量升高都有明顯的抑制效應，肝纖維化程度的緩解主要取決于肝組織內CTGF基因表達的下調。沉默CTGF siRNA基因對CCl4誘導的大鼠肝纖維化具有顯著的阻抑作用[27]。

大量動物實驗及體外細胞培養證實，靶向CTGF siRNA可抑制CTGF表達，抑制HSC活化、增殖以及ECM合成阻止肝纖維化進展。George等[28]應用Real-time PCR、免疫組織化學等方法在對體外培養HSC和動物肝纖維化模型的研究中發現，TGF-β1和CTGF基因的表達可被在siRNA介導下的CTGF基因沉默抑制，阻止HSC活化，下調結締組織蛋白積聚的水平。靶向CTGF siRNA可以高效、特異性地抑制大鼠HSCT6 中CTGF的基因表達，抑制效率在一定濃度和時間范圍內具劑量依賴性增高及時間限制特性。靶向CTGF siRNA對原代干細胞和HSC中CTGF表現出明顯的抑制作用。

Zhu等[29]的研究表明，序列特異性CTGF siRNA能明顯減少層粘連蛋白、透明質酸及Ⅲ、Ⅳ型膠原等ECM的合成。此外，還有研究發現，靶向CTGF siRNA能夠減少Ⅰ、Ⅲ型膠原、TIMP和CTGF等的表達，抑制TGF-β1的促纖維化效應，CTGF有可能是Ⅰ型和Ⅲ型膠原合成抑制上游調控因素。在大鼠，CTGF siRNA治療成為CCl4誘導的肝纖維化中HSC的特殊治療策略[30]。

3 展望

近年來眾多研究表明，由siRNA介導的CTGF基因沉默在肝纖維化的治療方面打開了嶄新的局面，開辟了新的途徑。CTGF siRNA特異性抑制CTGF表達的應用，有望為治療肝纖維化提供新途徑。

[1] 解淑蕊，張曉嵐.肝星狀細胞的起源、分布于表型轉變[J].細胞生物學雜志，2009，31（1）：45-50.

[2] Kordes C，Sawitzal I，Haussinger D.Hepatic and pancreatic stellate cells in focus[J].Biol Chem，2009，390（10）：1003-1012.

[3] Atzori L，Poli G，Perra A.Hepatic stellate cell：a srar cell in the liver[J].Int J Biochem Cell Bol，2009，41（8-9）：1639-1642.

[4]花冠春，孫旻.肝星狀細胞在肝纖維化治療中的研究進展[J].中國現代醫生，2009，47（26）：14-16.

[5] Novo E，di Bonzo LV，Cannito S，et al.Hepatic myofibroblasts：a heterogeneous population of multifunctional cells in liver fibrogenesis[J].Int J Biochem Cell Biol，2009，41（11）：2089-2093.

[6] Friedman SL.Hepatic fibrosis-overview [J].Toxicology，2008，254（3）：120-129.

[7] Friedman SL.Mechanisms of hepatic fibrogenesis[J].Gastroenterology，2008，134（6）：1655-1669.

[8] 蕭瑤，宋后燕.肝星形細胞在肝纖維化發生及治療中的作用[J].生命的化學，2005，25（5）：391-393.

[9] Hernandez-Gea V，Friedman SL.Pathogenesis of liver fibrosis[J].Annu Rev Pathol，2011，6：425-456.

[10] Chen YX，Weng ZH，Zhang SL.Notch3 regulates the activation of hepatic stellate cells[J].World J Gastroenterol，2012，18（12）：1397-1403.

[11] 張進良，陽丹才讓，樊海寧.肝硬化中肝星狀細胞信號分子的研究[J].醫學綜述，2010，16（24）：3699-3702.

[12] Kodama T，Takehara T.Increases in p53 expression induce CTGF synthesis by mouse and human hepatocytes and result in liver fibrosis in mice[J].Journal of Clinical Investigation，2011，121（8）：3343-3356.

[13] Kolios G，Valatas V，Kouroumalis E.Role of Kupffer cells in the Pathogenesis of liver disease [J].World J Gastroenterol，2006，12（46）：7413-7420.

[14] Ahima RS，Osei SY.Leptin signaling [J].Physiol Behav，2004，81：223-241.

[15] Gao RP，Brigstock DR.Connective tissue growth factor hammerhead ribozyme attenuates human hepatic stellate cell function [J].World J Gastroenterol，2009，15（30）：3807-3813.

[16] Gressner OA，Gressoer AM.Connective tissue growth factor：a fibrogenic master switch in fibrogenic liver diseases[J].Liver International，2008，28（8）：1065-1079.

[17] Gressner OA，Weiskirchen R，Gressner AM.Evolving concepts of liver fibrogenesis provide new diagnostic and therapeutic options[J].Comp Hepatol，2007，6（7）：1-13.

[18] Borkham-Kamphorst E，van Roeyen CR，Van de Leur E，et al.CCN3/NOV small interfering RNA enhances fibrogenic gene expression in primary hepatic stellate cells and cirrhotic fat storing cell line CFSC[J].J Cell Commun Signal，2012，6（1）：11-25.

[19] Qi W，Twigg S，Chen X，et al.Intergrated actions of transforming growth factor-batal and connective tissue growth factor in renal fibrosis[J].Am J Physio Renal Physiol，2005，（288）：F800-F809.

[20] Leask A，Abraham DJ.All in the CCN family：essential matricellular signaling modulators emerge from the bunker[J].J Cell Sci，2006，119（23）：4803-4810.

[21] Tong Z，Chen R，Alt DS，et al.Susceptibility to liver fibrosis in mice expressing a connective tissue growth factor transgene in hepatocytes[J].Hepatology，2009，50（3）：939-947.

[22] Kovalenko E，Tacke F，Gressner OA.Validation of connective tissue growth factor （CTGF/CCN2） and its gene polymorphisms as noninvasive biomarkers for the assessment of liver fibrosis[J].Journal of Viral Hepatitis，2009，16（9）：612-620.

[23] Song E，Lee SK，Wang J，et a1.RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis[J].Nat Med，2003，9（3）：347-351.

[24] Cheng K，Yang N，Mahato RI.TGF-beta1 gene silencing for treating liver fibrosis[J].Mol Pharm，2009，6：772-779.

[25] Li GM，Li DG，Xie Q，et al.RNA interfering connective tissue growth factor prevents rat hepatic stellate cell activation and extracellular matrix production[J].J Gene Med，2008，10（9）：1039-1047.

[26] 李光明，李定國，謝青，等.沉默結締組織生長因子對大鼠肝纖維化及細胞外基質積聚的影響[J].中華肝臟病雜志，2008，16（3）：188-192.

[27] 李光明，李定國，范建高，等.沉默結締組織生長因子對大鼠肝纖維化的影響[J].中華肝臟病雜志，2010，18（11）：822-825.

[28] George J，Tsutsumi M.siRNA-mediated knockdown of connective tissue growth factor prevents N-nit rosodimethylamine-induced hepatic fibrosis in rats[J].Gene Ther，2007，14（10）：790-803.

[29] Zhu YH，Ren WH，Sun CG，et al.Disruption of connective tissue growth factor by short hairpin RNA inhibits collagen synthesis and extracellular matrix secretion in hepatic stellate cells [J].Liver Int，2008，28（5）：632-639.

[30] Brigstock DR.Strategies for blocking the fibrogenic actions of connective tissue growth factor （CCN2）：from pharmacological inhibition in vitro to targeted siRNA therapy in vivo[J].J Cell Commun Signal，2009，3（1）：5-18.