HPLC法測定注射用阿洛西林鈉樣品中氨芐西林的含量

顧 珉

（蘇州市藥品檢驗(yàn)所，江蘇 蘇州 215002）

阿洛西林（Azlocillin）是第三代廣譜半合成青霉素，對G+菌、G-菌及厭氧菌有效，能強(qiáng)烈地對抗綠膿桿菌，適用于G+菌、G-菌及厭氧菌引起的感染，包括敗血癥、腦膜炎、心內(nèi)膜炎、化膿性腦膜炎、腹膜炎及下呼吸道、胃腸道、膽道、泌尿道、骨及軟組織、生殖器官、皮膚燒傷等疾病[1]。20世紀(jì)80年代以來，先后在英國、美國、日本、意大利、荷蘭、瑞士等獲得臨床應(yīng)用，本品耐受性好，不良反應(yīng)發(fā)生率低，且多輕微，類似青霉素的不良反應(yīng)，在國內(nèi)的青霉素類藥品應(yīng)用中有一定的市場占有率[2]。注射用阿洛西林鈉原收載于《國家藥品標(biāo)準(zhǔn)新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)》第48冊WS1-（X-002）-2004Z，該標(biāo)準(zhǔn)在有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)中分別對雜質(zhì)總量和單個(gè)最大雜質(zhì)的量進(jìn)行控制；目前該品種已收載入《中國藥典》2010年版二部[3]，提高了有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)下雜質(zhì)總量和單個(gè)最大雜質(zhì)的量的限度規(guī)定，但方法均基于自身稀釋對照法，而未見有對阿洛西林鈉注射劑中相關(guān)雜質(zhì)成分的含量測定方法的報(bào)道。阿洛西林鈉在結(jié)構(gòu)上可看做氨芐西林的衍生物[4]，阿洛西林鈉原料藥大都以氨芐西林三水酸為起始原料，經(jīng)與側(cè)鏈1-氯甲酰基-2-咪唑烷酮縮合得阿洛西林酸，成鈉鹽后，真空冷凍干燥制得阿洛西林鈉。而市售的注射用阿洛西林鈉大部分采用無菌原料藥分裝的生產(chǎn)工藝，因此企業(yè)在原料藥質(zhì)量控制上未把好關(guān)，可能會在最終產(chǎn)品造成樣品中氨芐西林的量過高，影響最終樣品的純度。而注射用阿洛西林鈉的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)對于樣品中的雜質(zhì)氨芐西林無法進(jìn)行準(zhǔn)確的定量控制，因此本文提出了注射用阿洛西林鈉中氨芐西林含量測定的高效液相色譜方法。該方法的建立為進(jìn)一步完善注射用阿洛西林鈉的質(zhì)量評價(jià)體系、優(yōu)化其生產(chǎn)工藝提供參考。

1 儀器與試藥

儀器：SHIMADZU LC-20高效液相色譜儀（日本島津公司）；AE240型電子分析天平（瑞士Melttler公司）。乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。氨芐西林對照品（批號130410-200706，含量85.7%，中國藥品生物制品檢定所），阿洛西林對照品（批號130566-200601，含量93.7%，中國藥品生物制品檢定所）。注射用阿洛西林鈉（瑞陽制藥有限公司，批號10091913，11021014，10122112，11010513，11011511；蘇州二葉制藥有限公司，批號100804，101208，101204，101206，100904；浙江金華康恩貝有限公司，批號DB1005018-2，DC1012005-4，DA1007004-3，DC1102013-6，DC1102004-5）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制

取氨芐西林對照品（中檢所，批號130410-200706，含量85.7%）加流動相制成每1mL中約含1000μg的溶液，作為對照品儲備溶液。取注射用阿洛西林鈉樣品，加流動相溶解并定量稀釋制成每1mL中約含阿洛西林0.5mg的溶液，作為供試品溶液；精密量取溶液20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算。

圖1 對照品及樣品色譜圖

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)

色譜柱：Kromasil 100A C18柱（200mm×4.6mm，5μm）；流動相：磷酸鹽緩沖液（取無水磷酸氫二鉀4.09g和磷酸二氫鉀，加水溶解并稀釋至1000mL）-乙腈（85∶15）；流速為每分鐘1.0mL，檢測波長：210nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量20μL。分別精密吸取氨芐西林和阿洛西林對照品溶液、空白對照（流動相）和供試品溶液各20μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖（圖1）。理論板數(shù)以氨芐西林峰計(jì)算均＞9000，氨芐西林和阿洛西林的分離度均＞15.0，且流動相對氨芐西林檢出無干擾。

2.3 線性關(guān)系

取氨芐西林對照品儲備溶液，將其分別稀釋0.5、0.2、0.1、0.02、0.01、0.005倍。分別進(jìn)樣20μL，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測定其峰面積，以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程為y=51042x+213583，r2=0.9997，線性范圍0.0954~19.0802μg。

2.4 精密度試驗(yàn)

分別精密吸取0.5倍對照品溶液20μL，平行進(jìn)樣5次，以峰面積計(jì)算色譜系統(tǒng)精密度，氨芐西林峰面積RSD值為0.168%（n=5）。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取注射用阿洛西林鈉樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，分別在1，2，4，8，16，24h進(jìn)樣，每次20μL，測定峰面積。結(jié)果氨芐西林峰面積的RSD值為1.95%，表明氨芐西林在樣品溶液條件下保持穩(wěn)定。

2.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

稱取”2.5”項(xiàng)下同一批注射用阿洛西林鈉樣品9份，每一份約50mg，精密稱定，置100mL容量瓶中。將9份樣品平均分成3組，每組樣品分別精密加入1000μg/mL、200μg/mL、100μg/mL的氨芐西林對照品溶液各5mL，按“2.1”項(xiàng)下溶解樣品，并按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算回收率。結(jié)果氨芐西林的平均加樣回收率為97.8%，RSD為1.7%。

2.7 樣品中氨芐西林含量測定結(jié)果

取市售的的3個(gè)廠家的注射用阿洛西林鈉各5個(gè)批號樣品，每批樣品取3份，每份樣品取約50mg，精密稱定，按照“2.1”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，精密吸取制備的樣品溶液各20μL進(jìn)樣，依法測定，根據(jù)氨芐西林峰面積積分值，外標(biāo)法計(jì)算注射用阿洛西林鈉樣品中氨芐西林的平均含量，并按照《中國藥典》2010年版二部注射用阿洛西林鈉有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)下方法計(jì)算氨芐西林含量，各批次樣品結(jié)果見表1。

表1 注射用阿洛西林鈉中氨芐西林含量測定結(jié)果

3 討 論

由表1數(shù)據(jù)，我們可以看到某廠家部分批號樣品檢出氨芐西林含量比較高，如10091913和11021014批樣品檢出氨芐西林含量在0.5%以上，另有10122112和11011511批樣品未檢出氨芐西林，表明不同批次樣品的氨芐西林含量有差異，該企業(yè)應(yīng)更加關(guān)注不同批次的原料藥質(zhì)量的差異性，找出造成質(zhì)量差異的工藝或處方原因，以達(dá)到不同批次的最終產(chǎn)品質(zhì)量的可控性；某廠家的100804，101208，101204，101206，100904等5批樣品檢出氨芐西林的量均在0.5%附近，相比另一個(gè)廠家的樣品氨芐西林檢出量均處于高位數(shù)值，原料藥質(zhì)量還有很大的提高余地。

目前中國藥典對注射用阿洛西林鈉中有關(guān)物質(zhì)的檢查方法采用樣品的自身稀釋對照法，在一定程度上實(shí)現(xiàn)了對注射用阿洛西林鈉樣品中單個(gè)雜質(zhì)和雜質(zhì)總量的控制，然而該方法假定樣品中的雜質(zhì)與主成分阿洛西林有相同的色譜響應(yīng)比（響應(yīng)峰面積/成分質(zhì)量濃度），造成了對特定雜質(zhì)氨芐西林的控制結(jié)果就不一定準(zhǔn)確，通過對氨芐西林的含量測定結(jié)果與按《中國藥典》注射用阿洛西林鈉有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)下的單個(gè)雜質(zhì)和雜質(zhì)總量結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，氨芐西林的量與二者的相關(guān)性都很低（Pearson系數(shù)分別為0.006和0.353）。如果只控制有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)下的單個(gè)雜質(zhì)和雜質(zhì)總量這兩項(xiàng)指標(biāo)，就會給我們企業(yè)在樣品或原料藥的質(zhì)量監(jiān)控方面帶來誤導(dǎo)，因此建議有關(guān)部門在制定注射用阿洛西林鈉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)應(yīng)考慮對特定雜質(zhì)氨芐西林進(jìn)行控制。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所建立的方法能夠簡便、快速、準(zhǔn)確的測定注射用阿洛西林鈉中氨芐西林的含量，對于生產(chǎn)企業(yè)可以作為該制劑的一個(gè)質(zhì)量控制的參考標(biāo)準(zhǔn)。

[1]王繼紅.阿洛西林鈉臨床應(yīng)用情況[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2009,18(13):1571.

[2]錢元恕,王其南.阿洛西林的抗菌作用及臨床藥理[J].中國抗生素雜質(zhì),1990,15(6):463-472.

[3]中國藥典委員會.中國藥典:二部[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010:400-401.

[4]陸潤鐘.抗假單孢菌的半合成青霉素:阿洛西林[J].國外醫(yī)藥抗生素分冊,1989,10(2):105-111.