白細(xì)胞介素21對(duì)SHIV感染的恒河猴外周血CD8+T細(xì)胞分泌γ干擾素的影響

趙長(zhǎng)城，高錫強(qiáng)，吳芳新，張偉倫，薛 婧，魏 強(qiáng)，秦 川

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

IL-21是一種新近發(fā)現(xiàn)的、具有免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，可通過(guò)多條途徑影響CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的抗病原體作用［1］，但目前對(duì)于 IL-21在抗 SIV/SHIV感染中的作用研究很少。本研究測(cè)定了IL-21誘導(dǎo)SHIV感染猴外周血CD8+T細(xì)胞分泌 IFN-γ的水平，以期掌握 IL-21體外誘導(dǎo)病毒特異性的細(xì)胞免疫的動(dòng)力學(xué)規(guī)律，為今后艾滋病發(fā)病機(jī)制的研究、HIV候選疫苗的篩選提供參考。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

健康猴和SHIV1157ipd3N4感染的中國(guó)恒河猴EDTA抗凝全血。

1.2 主要試劑

Mouse anti-monkey CD3 Ab(Invitrogen)，Purified anti-human CD28Ab(BD)，APC anti-human IFN-γ Ab(BioLegend)，F(xiàn)ITC anti-human CD4Ab (BioLegend)，PE anti-human CD8a Ab(BioLegend)，Brefeldin A(BFA)(BioLegend)，Triozol(Invitrogen)，AMV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、Ex Taq DNA聚合酶(大連寶生物)，rh IL-21(Invitrogen)，Monkey IFN-γ ELISAPROkit(Mabtech)，淋巴細(xì)胞分離液 Ficoll-PaqueTMPLUS(GE)，RPMI 1640完全培養(yǎng)基(含10%FCS、2.5%丙酮酸鈉、1%非必需氨基酸、2%雙抗)。

1.3 RT-PCR引物設(shè)計(jì)及合成

恒河猴 IFN-γ基因上下游引物序列［2］分別為5'-GCTTTTCAGCTCTGCATTGT-3'和5'-CGACAGTTC AGCCATCATTTG-3'，GAPDH上下游引物序列［3］分別 為5'-ACCACCATGGAGAAGGCTGG-3'和 5'-GGATGATGTTCTGGAGAGCC-3'，所有引物均由Invitrogen公司合成。

1.4 外周血CD8T淋巴細(xì)胞的分離

分離猴外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)，用CD8+T細(xì)胞陽(yáng)性磁珠 CD8microbead kit nonhuman-primate (Miltenyi Biotec)分選出CD8+T細(xì)胞。再用 RPMI 1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5%CO2孵箱，備用。

1.5 ELISA檢測(cè)IL-21誘導(dǎo)CD8T細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ濃度

用RPMI 1640完全培養(yǎng)基調(diào)PBMCs濃度為1.0×106/mL，24孔板中每孔加入1m L。每孔分別加入0、1、5、10和 15ng/m L IL-21和 1μg/m L anti-CD3刺激 48h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。應(yīng)用Human IL-21ELISA MAXTMDeluxe SET(BioLegend)檢測(cè)上清液中IFN-γ的濃度。

1.6 RT-PCR檢測(cè)IL-21誘導(dǎo)CD8T細(xì)胞IFN-γ m RNA的表達(dá)水平

加入1μg/m L anti-CD3和10ng/m L IL-21刺激5.0×105個(gè)健康猴和感染猴 CD8+T細(xì)胞48h，同時(shí)以未刺激的CD8+T細(xì)胞作為陰性對(duì)照。TRIzol法提取細(xì)胞總RNA。將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增 IFN-γ基因片段。擴(kuò)增體系為20μL，其中10×Ex Taq buffer 2μL、dNTPs 2μL、Ex Taq DNA聚合酶 0.2μL、上下游引物(20μM/μL)各0.8μL、cDNA 2μL、滅菌去離子水12.2μL。反應(yīng)條件為94℃5min，94℃30s(×35)，60℃30s(×35)，72℃ 1min(×35)，72℃延伸5min。取PCR產(chǎn)物5μL，在2%瓊脂糖凝膠上電泳。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)分析 IL-21誘導(dǎo) IFN-γ陽(yáng)性CD8T細(xì)胞百分比

用完全培養(yǎng)基調(diào)PBMCs濃度為1.0×106/m L。實(shí)驗(yàn)一：預(yù)先用1μg/m L anti-CD3和1μg/m L anti-CD28孵育 PBMC 1h，接著分別在加入 10μg/m L BFA后1、2、3、4、5和6h加入10ng/m L IL-21。實(shí)驗(yàn)二：設(shè)CD3/CD28組、IL-21組、CD3/CD28+IL-21組，并設(shè)空白對(duì)照組。CD3/28組和 CD3/28+ IL-21組分別加入 1μg/m L anti-CD3 +1μg/m L anti-CD28孵育 48h后，IL-21組和 CD3/CD28 + IL-21組分別加入10ng/m L IL-21，以上四組均在實(shí)驗(yàn)前5h加入1μg/mL BFA。

孵育結(jié)束后，首先進(jìn)行胞外 anti-CD8、CD3Ab染色，接著固定細(xì)胞、滲透。最后，染胞內(nèi)anti-IFN-γ抗體。檢測(cè)分泌 IFN-γ的CD8+T細(xì)胞所占的百分比。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。各組間指標(biāo)比較用 t檢驗(yàn)，＊＊＊表示P＜0.0001，＊＊表示P ＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 IL-21誘導(dǎo) SHIV感染的CD8T細(xì)胞分泌IFN-γ的最佳作用濃度分析

未用IL-21刺激時(shí)，CD8+T細(xì)胞分泌 IFN-γ的量為1046.97±60.61pg/m L。當(dāng)IL-21的濃度從1ng/m L增加到10ng/m L時(shí)，其誘導(dǎo)感染的CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ的量也相應(yīng)增加，并在IL-21為10 ng/m L時(shí)IFN-γ分泌量達(dá)到峰值(3280.17±267.42pg/m L)。與 5ng/m L IL-21誘導(dǎo)的IFN-γ分泌量(1406.93±345.84pg/mL)相比，10ng/mL IL-21誘導(dǎo)的IFN-γ分泌量明顯增加，兩者之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0018)。但15ng/mL IL-21誘導(dǎo)的IFN-γ分泌量(2964.40±135.92pg/m L)與 10ng/m L IL-21組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P = 0.1423)(圖1)。

圖1 不同劑量IL-21處理的CD8+T細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ濃度Fig.1 IFN-γ concentrations in the culture supernatant of CD8+T cells stimulated with IL-21at different doses

2.2 相同濃度IL-21刺激正常和感染 CD8T細(xì)胞效果的比較

在沒(méi)有加入 IL-21之前，不論是正常還是感染的CD8+T細(xì)胞，均產(chǎn)生一定基礎(chǔ)水平的IFN-γ (972.39±262.36pg/m L vs.1118.32±232.31pg/m L)，且兩者差異不顯著(P＞0.05)。10ng/m L IL-21處理后，感染的CD8+T細(xì)胞分泌的IFN-γ量(3019.58±203.09 pg/m L)明顯低于正常的CD8+T細(xì) 胞(7510.25 ± 437.76 pg/m L)(P ＜0.0001)(圖2)。

圖2 IL-21誘導(dǎo)正常和感染CD8+T細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ濃度Fig.2 IFN-γ concentrations in the culture supernatant of healthy and infected CD8+T cells induced with IL-21

2.3 IL-21處理后正常和感染 CD8T細(xì)胞分泌IFN-γ的比較

RT-PCR方法檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，IL-21誘導(dǎo)組IFN-γ mRNA的表達(dá)較未刺激組明顯增加(圖3)。

圖3 RT-PCR檢測(cè)感染CD8+T細(xì)胞中IFN-γ mRNA的表達(dá)Fig.3 Expression of IFN-γ mRNA in the infected CD8+T cells by assayed by RT-PCRM.2000bp marker；“+”：Stimulated with IL-21；“-”：Unstimulated with IL-21

2.4 IL-21處理后 CD8T細(xì)胞分泌 IFN-γ的分析

適當(dāng)?shù)拇碳r(shí)間是檢測(cè)細(xì)胞因子的關(guān)鍵。因此，我們選擇了不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，隨著IL-21刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，分泌IFN-γ的CD8+T細(xì)胞的百分比逐漸增加(圖4)，并在刺激4h時(shí)達(dá)到最高，隨后逐漸下降。圖5即為IL-21刺激CD8+T細(xì)胞4h時(shí)的流式圖。

圖4 不同時(shí)間刺激后IFN-γ陽(yáng)性CD8+T細(xì)胞的百分比Fig.4 The percentage of IFN-γ-positive CD8+Tcells after different times of IL-21stimulation

IL-21誘導(dǎo)培養(yǎng)PBMCs 48h后，應(yīng)用流式技術(shù)檢測(cè)不同刺激條件下，分泌 IFN-γ的CD8+T細(xì)胞所占全部 CD8+T細(xì)胞的百分比。與陰性對(duì)照組［(0.28±0.08)%］相比，CD3/CD28組［(1.55± 0.15)%］、IL-21組［(0.74±0.10)%］，CD3/CD28+IL-21聯(lián)合組［(2.04±0.20)%］均能誘導(dǎo) IFN-γ陽(yáng)性CD8+T細(xì)胞所占的比例增加，且存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異(P＜0.0001)。單獨(dú) IL-21組誘導(dǎo) IFN-γ表達(dá)的作用弱于CD3/CD28組，但在CD3/CD28的

圖5 IL-21刺激CD8+T細(xì)胞4h后IFN-γ陽(yáng)性細(xì)胞百分率Fig.5 The percentage of IFN-γ-positive CD8+T cells stimulated with IL-21for 4h

圖6 不同刺激源誘導(dǎo)的IFN-γ陽(yáng)性CD8+T細(xì)胞的比較Fig.6 Comparison of the percentages of IFN-γ-positive CD8+T cells treated by different stimulators(CD3/CD28，IL-21，CD3/CD28+IL-21mixture)，detected by flow cytometry.協(xié)同下，IL-21可以顯著誘導(dǎo)IFN-γ的表達(dá)(圖6)。

3 討論

適應(yīng)性免疫反應(yīng)在機(jī)體抗 HIV/SIV感染中具有非常重要的作用。細(xì)胞免疫在控制病毒復(fù)制，延緩疾病進(jìn)程的作用已得到證實(shí)［4］。SHIV/恒河猴模型體內(nèi)存在特異性CD8+T淋巴細(xì)胞參與的抗病毒免疫反應(yīng)，IFN-γ是免疫系統(tǒng)中非常重要的免疫調(diào)節(jié)因子，具有抗病毒，免疫調(diào)節(jié)和抗細(xì)胞異常增殖的作用，與病毒性疾病的嚴(yán)重程度戚戚相關(guān)。CD8+T細(xì)胞是 IFN-γ合成的主要細(xì)胞［5］。本文研究了IL-21對(duì) SHIV感染 CD8+T細(xì)胞分泌 IFN-γ的作用，以及不同的條件培養(yǎng)基對(duì)于產(chǎn)生IFN-γ的影響。這些結(jié)果證實(shí)IL-21能調(diào)節(jié)IFN-γ的產(chǎn)生，提示IL-21在機(jī)體抗HIV/SIV感染中發(fā)揮積極的影響。

IL-21具有促進(jìn)感染CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ的作用。CD8+T淋巴細(xì)胞是體內(nèi)主要的效應(yīng)細(xì)胞，研究表明，體外實(shí)驗(yàn)中IL-21可誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ［6］。據(jù)報(bào)道，IL-21對(duì)正常的CD8+T細(xì)胞誘導(dǎo)IFN-γ呈劑量相關(guān)性［7］。但本文應(yīng)用 IL-21刺激SHIV感染恒河猴外周血 CD8+T細(xì)胞，研究 IL-21對(duì)SHIV感染的CD8+T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)IFN-γ的能力，從圖1可知，10ng/m L IL-21誘導(dǎo)SHIV感染恒河猴外周血 CD8+T細(xì)胞分泌 IFN-γ效果最佳，并不呈劑量相關(guān)性。由圖2可見(jiàn)，使用相同濃度的IL-21分別誘導(dǎo)正常和感染的CD8+T細(xì)胞，兩者產(chǎn)生的IFN-γ均有不同程度的提高。但正常的CD8+T細(xì)胞分泌的IFN-γ量顯著高于感染的CD8+T細(xì)胞。結(jié)果提示，SHIV的感染部分影響了CD8+T細(xì)胞的效應(yīng)功能。本研究結(jié)果一方面證實(shí)了IL-21的確可以在一定程度上恢復(fù)缺失的CD8+T細(xì)胞功能，同時(shí)也說(shuō)明，單獨(dú)IL-21尚不能完全糾正缺失的功能，以后需在IL-21與其協(xié)同作用物上深入研究。有報(bào)道證實(shí)，當(dāng)它與IL-15或 IL-18組合應(yīng)用時(shí)，顯示出明顯的協(xié)同作用，強(qiáng)烈誘導(dǎo)細(xì)胞分泌IFN-γ［8］。但其中機(jī)制尚不明了。應(yīng)用RT-PCR方法從mRNA水平檢測(cè)的結(jié)果，與應(yīng)用ELISA方法從蛋白質(zhì)水平檢測(cè)的結(jié)果是一致的。

不同的條件培養(yǎng)基和刺激時(shí)間影響IL-21誘導(dǎo)的感染CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生 IFN-γ的能力。目前，對(duì)細(xì)胞免疫的研究已經(jīng)存在多種替代方法，而流式細(xì)胞術(shù)具有多色熒光染色的優(yōu)勢(shì)。應(yīng)用其檢測(cè)胞內(nèi)細(xì)胞因子，特別是對(duì) IFN-γ的檢測(cè)可以用來(lái)評(píng)價(jià)抗原特異性的細(xì)胞免疫水平。本研究應(yīng)用流式技術(shù)檢測(cè)IL-21誘導(dǎo) PBMCs后，結(jié)果證實(shí)，與對(duì)照組相比，IL-21組、CD3/CD28+IL-21聯(lián)合組中分泌IFN-γ的CD8+T細(xì)胞所占比例明顯增加，且存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異(P＜0.0001)。此外，在本次試驗(yàn)中我們也比較了不同的刺激時(shí)間產(chǎn)生 IFN-γ的能力。結(jié)果表明4h為刺激CD8+T細(xì)胞胞內(nèi)IFN-γ合成的最佳時(shí)間。因而推測(cè)IL-21對(duì)SHIV/恒河猴模型的免疫水平有調(diào)節(jié)作用，其機(jī)制與誘導(dǎo)IFN-γ產(chǎn)生有關(guān)，但要充分理解IL-21的抗病毒作用尚需進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)IL-21通過(guò)改善CD8+T細(xì)胞的功能從而發(fā)揮重要的保護(hù)性作用，其作用機(jī)制可能與誘導(dǎo) IFN-γ分泌有關(guān)。本研究結(jié)果為HIV/SIV感染的治療提供了新的思路。

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