應用酵母雙雜交系統篩選E2F1相互作用蛋白*

廉 超， 王曉通， 謝玉波， 肖 強△

(廣西醫科大學第一附屬醫院 1胃腸腺體外科，2麻醉科，廣西南寧530021)

在我國，胃癌的發病率及死亡率位居所有惡性腫瘤首位。而胃癌的發生發展是一個多步驟、多基因參與的復雜過程。E2F1轉錄因子(E2F1 transcription factor)作為重要的細胞周期相關轉錄因子，與腫瘤發生發展及細胞凋亡調控密切相關［1］。我們前期研究顯示，E2F1在人胃癌組織中呈高表達，在癌旁和正常組織中均呈低表達［2］，這提示E2F1的表達與胃癌的發生發展密切相關。本研究應用酵母雙雜交系統，以E2F1為誘餌蛋白，從人正常胃黏膜細胞的cDNA文庫中篩選出E2F1相互作用蛋白，為進一步研究E2F1影響胃癌發生發展的分子機制奠定了基礎。

材料和方法

1 材料

酵母表達載體pGBKT7、酵母表達載體pGADT7、人正常胃黏膜細胞 cDNA 文庫［3］和 pGBKT7－E2F1誘餌質粒［4］均由本實驗室保存;酵母菌AH109、SD酵母基礎培養基和－Trp－Leu－Ade－His營養缺陷培養基、－Trp－Leu營養缺陷培養基、YPAD培養基和X－Gal均購自Clontech;測序公司為北京蛋白質組研究中心(BPRC)。

2 方法

2.1 酵母感受態制備及文庫轉化效率測定 按照Clontech公司說明書(Matchmaker system Yeast Protocols Handbook)方法制備AH109感受態細胞，將pGBKT7－E2F1 pGADT7和文庫質粒共轉化酵母菌AH109，最終得到酵母菌種懸濁液10 mL，取10 μL 稀釋 107倍，再取 100 μL 涂布于 SD/－Trp－Leu的培養基營養缺陷型平板，30℃培養3～5 d，經觀察，共生長出18個單克隆，并據此計算文庫轉化效率。

2.2 酵母雙雜交篩選陽性克隆 將共轉化后的AH109首先劃線于SD/－Trp/－Leu/－Ade/－His培養基平板，30℃培養3～5 d，待長出克隆后，挑取，依次劃線于SD/－Trp/－Leu培養基平板，使其充分地生長復蘇。并同時劃線陽性對照(以pGBKT7－53和pGADT7－T質粒共轉染的AH109)和陰性對照(以 pGBKT7－Lam和pGADT7－T質粒共轉染的AH109)，待其達到良好生長狀態后(24 h左右)，再用滅菌絨布原位復制劃線至SD/－Trp/－Leu/－Ade/－His培養基平板，用以檢測His和Ade雙報告基因表型。與此同時亦復制劃線于鋪有濾紙的平板，30℃培養24 h左右，進行X－Gal濾膜分析，以檢測LacZ報告基因，篩選出陽性克隆20個。

2.3 回轉驗證及測序分析 將篩庫所得陽性克隆全部劃線于SD/－Trp/－Leu和 SD/－Trp/－Leu/－Ade/－His兩平板，與初篩時方法相同，兩板分別劃線陽性對照組和陰性對照組。劃線重復4次，觀察陽性克隆在平板上生長情況，之后進行X－Gal濾膜分析。通過反復劃線，一方面再次檢驗誘餌蛋白和文庫蛋白的相互作用，另一方面可使質粒分散排布，并能通過反復劃線對假陽性進行初步排除。將回轉陽性的質粒送北京蛋白質組研究中心測序，并將測序結果在NCBI上進行BLAST同源序列比對。

結 果

1 文庫篩選結果

按照Clontech公司說明書(Matchmaker system Yeast Protocols Handbook)要求，篩庫總轉化效率達到1.0×106cfu/μg表示文庫篩選試驗操作成功。經計算，文庫轉化效率為:18/100 ×107=1.8 ×106cfu/μg ＞1.0 ×106cfu/μg，故滿足文庫篩選要求，見圖1。

Figure 1.The growth of yeast clones in SD/－Leu－Trp Petri dish.圖1 稀釋107倍后涂布于SD/－Leu－Trp平板上的單克隆生長情況

2 陽性克隆的鑒定

在SD/－Trp/－Leu/－Ade/－His培養基平板上共篩選得到陽性克隆21個。將這21個初篩的陽性克隆重新劃線于SD/－Trp/－Leu培養基平板，使其充分地生長復蘇，之后用滅菌絨布原位復制劃線于SD/－Trp/－Leu/－Ade/－His平板上，經X－Gal濾膜分析證實其中有21個陽性克隆表型為Ade+、His+、Leu+、Trp+和 LacZ+，見圖 2。

Figure 2.The growth of converted AH109 in SD/－Leu－Trp and SD/－Leu－Trp－His－Ade Petri dishes and the result of X－Gal staining(primary screening).A:positive control group(pGBKT7－53+pGADT－T);B:negative control group(pGBKT7－lam+pGADT－T).圖2 共轉化AH109在三平板上的生長情況

3 回轉驗證

將獲得的陽性質粒一對一與誘餌質粒pGBKT7－E2F－1重新共轉化AH109酵母菌后，重復劃線4次，經X－Gal濾膜分析，篩除1組假陽性克隆，最終得到表達His、Ade和LacZ的候選陽性克隆20個，見圖3。

Figure 3.The growth of converted AH109 in SD/－Leu－Trp and SD/－Leu－Trp－His－Ade Petri dishes and the result of X－Gal staining(secondary screening).A:positive control group(pGBKT7－53+pGADT－T);B:negative control group(pGBKT7－lam+pGADT－T).圖3 共轉化AH109在三平板上的生長情況

4 候選陽性克隆的測序及比對結果

經測序和同源序列比對，最終得到18個不同的候選基因序列，它們分別是:組織蛋白酶B(cathepsin B，CB)、SIVA1、干擾素調節因子7(interferon regulatory factor 7，IRF7)、鳥苷酸激酶1(guanylate kinase 1，GUK1)、ATP酶抑制因子1(ATPase inhibitory factor 1，ATPIF1)、核糖體蛋白 SA(ribosomal protein SA，RPSA)、纖溶酶原激活物抑制劑1 mRNA結合蛋白(serpine 1 mRNA binding protein 1，SERBP1)、精氨琥珀酸合酶1(argininosuccinate synthase 1，ASS1)、卵泡抑素類似物3(follistatin－like 3，FSTL3)、金屬硫蛋白 2A(metallothionein 2A，MT2A)、內質網鈣結合蛋白 1(reticulocalbin 1，RCN1)、WNT1可誘導信號通路蛋白2(WNT1 inducible signaling pathway protein 2，WISP2)、CDC42 效應蛋白 1(CDC42 effector protein 1，CDC42EP1)、可溶性半乳糖凝集素結合蛋白1(lectin galactoside－binding soluble 1，LGALS1)、中胚層發育候選2(mesoderm development candidate 2，MESDC2)、外切酶體成分7(exosome component 7，EXOSC7)和含EGF腓骨蛋白樣胞外基質蛋白1(EGF－containing fibulin－like extracellular matrix protein 1，EFEMP1)，還有一未知基因片段，見表1。

表1 E2F1相互作用蛋白的基因測序結果Table 1.Genetic sequence report of proteins interacting with E2F1

討 論

轉錄因子E2F家族在控制細胞周期的進展中起關鍵作用。E2F1作為E2F家族重要成員之一，是細胞周期調控機制Rb/E2F通路中重要的轉錄活化因子。它通過與Rb及相關蛋白等多種依賴細胞周期的蛋白質及酶類相互作用，調節細胞周期由G1期向S期過渡，是細胞增殖和發育所必需的因子之一。我們前期研究顯示:E2F1的高表達或沉默在體內及體外環境下均可明顯抑制胃癌細胞的增殖與生長，使細胞周期阻滯在G1/S期，胃癌細胞遷移和侵襲能力明顯減弱，并誘導腫瘤細胞的凋亡［5－8］，但其具體機制尚未明確。

本實驗應用酵母雙雜交系統最終成功篩選出18種E2F1相互作用蛋白，其中CB和SIVA1已被廣泛認可并已證實與E2F1及腫瘤發生發展密切相關。CB是細胞溶酶體內的一種半胱氨酸蛋白酶，能夠直接降解或激活纖溶酶原激活劑及基質金屬蛋白酶等而間接降解細胞外基質成分，CB對基底膜和細胞外基質的降解被認為是腫瘤侵襲與轉移的關鍵步驟之一［9］。近年來大量研究證實，CB在胃癌、腸癌、肺癌、乳腺癌、宮頸癌、子宮內膜癌、前列腺癌、神經膠質瘤、膀胱癌、黑色素瘤和甲狀腺癌等多種惡性腫瘤組織中均呈現高表達且CB活性遠高于鄰近正常組織［10－12］，這說明CB與惡性腫瘤的發生發展密切相關。此外，Gopinath等［13］研究發現，CB可明顯抑制p－ERK和c－Myc的表達，促使E2F1過表達，阻礙口袋蛋白的磷酸化進程，進而使p27表達上調，最終抑制腫瘤細胞的生長。SIVA是一種促凋亡蛋白，該蛋白與腫瘤壞死因子受體家族和抗凋亡Bcl－2家族密切相關。SIVA存在2種剪切變體，即SIVA1和SIVA2，其中SIVA1被認為對細胞凋亡的誘導起到至關重要的作用。最新研究表明，促凋亡基因SIVA是抑癌基因p53和E2F1的直接轉錄靶向基因，SIVA過表達不僅可誘導腫瘤細胞發生凋亡，還可抑制腫瘤的侵襲轉移［14－15］。Ray 等［16］也發現，pRb 高表達可使 E2F1 表達明顯增加，而E2F1表達上調會激活SIVA1轉錄途徑，促使SIVA1過表達，進而相繼激活caspase－9和caspase－3，最終誘導細胞凋亡。以上研究成果均表明，CB和SIVA1不僅在分子機制上與E2F1聯系緊密，更與惡性腫瘤的發生發展密切相關。因此，E2F1極有可能通過與CB和SIVA1相互作用，經過不同的信號轉導通路最終影響胃癌細胞生物學行為。另外，在本實驗中，除 CB 和 SIVA1外，MT2A、RPSA、GUK1、ATPIF1、SERBP1、ASS1、MESDC2、WISP2、RCN1、CDC42EP1、EXOSC7、EFEMP1、FSTL3、IRF7、LGALS1等基因均為本次酵母雙雜交系統篩選出的差異表達基因，提示這些基因與E2F1也可能有著密切的聯系。

酵母細胞是最簡單的真核細胞，其體內蛋白質合成后加工、修飾類型及其程度與哺乳動物的相應過程存在一定差異，因此酵母雙雜交的結果僅僅是初步提出相互作用的可能性，要進一步確認CB、SIVA1等蛋白與E2F1的關系，還需在哺乳動物細胞中加以驗證。對此，我們將會在未來的實驗中，選取篩選得到的相互作用蛋白構建真核表達載體，分別與E2F1共轉染體外培養的人胃癌細胞，以免疫共沉淀和激光共聚焦等方法進一步驗證其相互作用，進而明確E2F1影響胃癌發生發展的基因通路，從而為E2F1潛在的基因治療研究奠定基礎。

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