不同品系小鼠感染甲型流感病毒肺小血管內血栓形成

劉 穎，徐艷峰，鄧 巍，朱 華，黃 瀾，馬春梅，鮑琳琳，秦 川

（中國醫學科學院實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室）

急性肺動脈栓塞（pulmonary embolism，PE）是指內源性或外源性栓子堵塞肺動脈引起肺循環障礙的臨床和病理生理綜合征，臨床觀察和多項種群研究的證據顯示靜脈血栓栓塞VTE已經成為一種全球性嚴重的醫療保健問題。近年來眾多學者提出深靜脈血栓一肺栓塞DVT-PE是由于遺傳和（或）環境異常造成的一種多基因、多因素性疾病，并將外傷、手術、高齡、惡性腫瘤、妊娠、心衰、制動及口服避孕藥等列為其發生的危險因素。另外臨床實驗的統計數據表明流行性感冒與急性的肺動脈栓塞風險增加之間雖然還沒有明確的相關關系［1］，但已有流感病毒感染導致血栓形成的病例報道。2009年10月Agarwal等［2］報告的15例甲型H1N1流感者CT檢查中有5例肺栓塞。本研究使用不同免疫狀態的小鼠感染甲型流感病毒（H1N1和H3N2），觀察病毒感染后血栓形成的情況。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雌性4～6周 BALB/C小鼠（40只）和 NODScid小鼠（50只），雌性4～6周Scid小鼠，BALB/C-nu小鼠，NOD/LtJ小鼠（各33只）（由北京華阜康提供，合格證號：SCXK京 2009）；icosl-KO小鼠（10只）（由衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室提供）。小鼠按品系分籠飼養，實驗前3 d安置于生物實驗安全實驗室獨立送風隔離籠具（IVC）中適應環境，H1N1病毒感染實驗在 BSL-3實驗室中進行，H3N2病毒感染實驗在BSL-2實驗室中進行。

1.2 病毒

H1N1病 毒 A/California/7/2009（CA7）株，TCID50為 106。H3N2病毒 A/Brisbane/10/07株，TCID50為107。

1.3 病毒感染

H1N1病毒以106TCID50，對BALB/C小鼠、Scid小鼠、NOD/LTJ小鼠、BALB/C-nu小鼠、NOD-Scid小鼠和icosl-KO小鼠經乙醚麻醉后進行滴鼻攻毒，每只小鼠50μL，攻毒后每天觀察小鼠，分別于第4天、第6天、第7天、第8天和第14天處死小鼠取材檢測小鼠感染后的肺組織病毒載量和病理改變。實驗在中國醫學科學院實驗動物研究所ABL-3實驗室中進行。

H3N2病毒以107TCID50，對BALB/C小鼠、Scid小鼠、NOD/LTJ小鼠、BALB/C-nu小鼠、NOD-Scid小鼠和icosl-KO小鼠經乙醚麻醉后進行滴鼻攻毒，每只小鼠50μL，觀察期為14 d。分別于攻毒后第3天、第10天和第14天處死小鼠取材檢測感染后的肺組織病毒載量和病理改變。實驗在中國醫學科學院實驗動物研究所ABL-2實驗室中進行。

1.4 動物犧牲及標本處理

斷頸處死小鼠，打開胸腔，保留肺組織：取右上肺葉于組織裂解液中用于提取組織RNA；取右中肺葉于凍存管置-80℃冰箱中備份保存；其余肺葉與心、肝、脾、腎、腦、胃腸道等組織于10％中性甲醛溶液中固定。

1.5 肺組織總RNA提取及PCR檢測

RNeasy Mini Kit試劑盒（QIAGEN，74106）提取肺組織總RNA，反轉錄成cDNA。使用熒光染料Power SYBR Green PCR Master Mix（ABI，4367659）進行realtime PCR檢測（ABI STEPONE PCR儀）。擴增程序94℃3 min；94℃30 s，59℃30 s，72℃30 s，共35個循環；95℃，15 s；60℃ 1 min；95℃ 15 s。每次試驗的標準品作106copies/mL、105copies/mL、104copies/mL、103copies/m L、102copies/m L濃度梯度稀釋，陰性對照（H2O）與樣品一起提取RNA后做real-time PCR。通過讀取儀器數據得到病毒載量。

所用 H1N1亞型特異性引物為 SW-H1 F786 5’-AATAACATTAGAAGCAACTGG-3’， SW-H1 R920 5’-AGGCTGGTGTTTATRGCACC-3’，目的片段大小為153 bp；H3N2亞型特異性引物為 BR-10F 5’-GAGAATCCAGCACACAAGAG-3’，BR-10R 5’-TTCTCAGTTCAAGAGTGCTC-3’，目的片段大小為196 bp。

1.6 病理學檢查

10％中性甲醛溶液固定組織常規石蠟包埋，常規組織學處理，常規HE染色。肺組織切片纖維素特殊染色（Mallory磷鎢酸蘇木素改良染色，即PTAH改良染色），抗P選擇素抗體（北京瀚天科技有限公司提供）免疫組織化學染色。

2 結果

2.1 小鼠感染后存活情況和大體觀察

小鼠感染H1N1病毒后逐漸出現進食減少、消瘦、被毛逆立、弓背、反應遲鈍等，感染小鼠后感染死亡情況見表1、表2。剖檢時可見感染小鼠肺臟有明顯的充血和水腫，肺組織表面有局部實變，其他臟器未見明顯改變。

表1 H1N1感染小鼠后觀察到血栓形成的小鼠/取材小鼠和感染死亡情況，（單位：只）Tab.1 Observed number ofmice with thrombosis and number of dead m ice infected with H1N1 virus

表2 H3N2感染小鼠后觀察到血栓形成的小鼠/取材小鼠和感染死亡情況，（單位：只）Tab.2 Observed number ofmice with thrombosis and number of dead m ice infected with H3N2 virus

小鼠感染H3N2病毒后，一般狀態尚好，未見明顯的食欲減退和活動減少，觀察14 d均無死亡。剖檢時各品系感染小鼠肺臟均未見明顯的充血水腫，肺組織顏色正常，未見實變等改變，其他臟器未見明顯改變。

2.2 小鼠肺組織病毒載量檢測結果

攻毒后不同時間點處死小鼠取肺組織RT-PCR檢測流感病毒的表達量（表3、表4），各組小鼠均染毒。

表3 H1N1感染不同品系小鼠肺組織不同時間的病毒拷貝數Tab.3 Virus copy number in mice infected with H1N1 virus

表4 H3N2感染不同品系小鼠肺組織不同時間的病毒拷貝數Tab.4 Virus copy number in m ice infected with H3N2 virus

2.3 小鼠肺組織病理觀察結果

H1N1感染小鼠肺部病變較重，肺間質血管高度充血，肺泡間隔度增寬、融合，少量炎細胞浸潤，其中BALB/C小鼠和Scid小鼠病變面積較大。13只小鼠肺組織小血管內見血栓形成（圖1A、B）（血栓形成的小鼠數和取材小鼠數見表1）。其他臟器未見異常改變。

H3N2感染小鼠后，BALB/C小鼠和 BALB/C-nu小鼠，肺組織病變較重，肺泡間隔明顯增寬，血管擴張充血，間質炎細胞浸潤，肺泡縮小變形；NODScid小鼠、Scid小鼠、NOD/LTJ小鼠和 icosl-KO小鼠，肺組織病變較輕，肺泡間隔明顯增寬，血管擴張充血，間質少量炎細胞浸潤。6只小鼠肺組織小血管內見血栓形成（圖1C、D）（血栓形成的小鼠數和取材小鼠數見表2）。其他臟器未見異常改變。

PTAH改良染色顯示觀察到的血栓中有纖維蛋白，P選擇素的免疫組織化學染色血栓顯色為陽性，即血栓中有活化聚集的血小板（圖1E、F）（圖1見文后插1）。

3 討論

本實驗中使甲型流感病毒H1N1和H3N2感染小鼠，其中H1N1毒力較強，動物死亡率較高，H3N2毒力較溫和，沒有動物死亡。兩種病毒感染小鼠后取小鼠肺組織提取RNA進行PCR檢測，均得到一定數量的病毒RNA拷貝，不同組別在數量上有所差異，但差異無統計學意義。感染小鼠均觀察到肺組織病理改變，并在多只動物的肺組織內觀察到血栓形成，多位于直徑20～60μm的小血管內，最大的見于平均直徑90μm血管內。根據特殊染色和免疫組織化學的結果血栓成分主要是纖維素和血小板。所以從成分和形成位置來看與PE體循環來源的混合血栓栓子經肺循環進入肺動脈不同，我們觀察到的血栓可能是在肺小血管中原位形成的。另外，不管是H1N1還是H3N2感染小鼠，感染早期在小靜脈和毛細血管中出現血栓的可能性相對較大，也可能是由于隨著時間延長早期形成的血栓又有部分溶解。這與一項針對2 258名泌尿系統感染和3 375名呼吸道感染的研究顯示的結果相一致，感染患者的DVT和PE的發病風險顯著上升，并在最初的兩周達到高峰，在隨后的數月中患病風險逐漸降低，至一年以后降至基線水平［3］。

實驗中用到的不同品系的小鼠，其免疫系統狀態各有不同：Scid小鼠存在T、B細胞缺陷；NOD/LtJ小鼠存在NK細胞缺陷，也因發生自身免疫常用于1型糖尿病的研究；NOD-Scid小鼠存在T、B、NK細胞缺陷；BALB/C-Nu小鼠存在 T細胞缺陷；Icosl-KO小鼠則有T輔助細胞異常分化，脾臟生發中心數量減少、體積縮小，T、B細胞相互作用異常；BALB/C小鼠作為對照小鼠，其沒有免疫細胞種類的缺陷，于6月齡以后可能出現免疫球蛋白增多。不同病毒感染小鼠后，在不同品系小鼠均觀察到有血栓的形成。H1N1和H3N2感染小鼠后各品系小鼠血栓出現情況并不完全一致，其中BALB/c小鼠、NOD/LtJ小鼠和NOD-Scid小鼠都觀察到血栓的形成，形成比例在兩種病毒的感染中略有差異；Scid小鼠僅在H3N2感染后觀察到血栓形成，而BALB/c-Nu小鼠和icosl-KO小鼠僅在 H1N1感染后觀察到血栓形成，可能與病毒毒力和感染特性有關。比較各品系小鼠血栓形成結果，NK細胞可能在血栓形成過程中的作用不大，T細胞的部分功能，或T細胞與其他免疫成分的相互作用在血栓形成過程中發揮一定作用，但由于樣本量較少，影響品系間差異的觀察，產生一定的偏差，且免疫系統內的各種成分間相互作用復雜，故對免疫成分參與血栓形成的機制尚需進一步實驗證實。

已有研究發現流感引起的炎癥反應能夠導致血栓調節素水平的下調，抗凝血激活蛋白C水平下降，纖溶酶原激活物抑制劑（plasm inogen activator inhibitor-l，PAI-1）水平升高，從而導致纖維帶白溶解作用下降；且炎癥本身能夠誘導血小板數量的升高［4］。也曾有尸檢發現感染 A型 H1N1流感病毒的患者肺周圍小血管內見到小血栓形成［5］。也有報道人巨細胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）感染急性期與血栓形成有關，而且抗病毒藥物的使用能夠抑制HCMV感染引起的血小板的粘附和聚集活性增強；體外HCMV感染人包皮成纖維細胞可使血管假性血友病因子（von W illebrand factor， vWF）、細胞間粘附分子 （intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）和血管細胞粘附分子（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）的表達水平增高，從而促進血栓形成［6］。一項對1986年至2004年十多年間發表的文獻的總結性研究發現 HIV感染增加了患者的血液凝固性和血管內皮的活化，同時臨床也觀察到病毒感染還可能引起病人肺動脈壓的改變，從而造成HIV感染者血栓性疾病的發病風險升高［7］。所以病毒感染對靜脈血栓形成有一定的影響，且某些病毒感染本身即可導致血管內皮的損傷和活化，也與病毒感染后可能引發其他的感染和自身免疫反應有一定的關系。

PE具有多種臨床表現譜，發病的危險因素也多種多樣，根據 Rudolf Virchow提出的經典的血栓形成三要素學說，將外科術后，創傷，長途飛行造成的制動作用、妊娠狀態、肥胖、高齡、惡性腫瘤和口服避孕藥等都成為PE的危險因素。但臨床上以此為依據制定的發病風險分級和預防性治療對PE的發病率和病死率的控制效果不明顯，且臨床上確也觀察到有些患者VTE的發生找不到易辨認的危險因素。隨著環境的改變和人口流動性的增加，病毒感染在人群中越來越普遍，一些毒力并不強的病毒感染發病隱匿，很容易被臨床忽視，但卻在很大程度上影響了人體的免疫狀態，引起內環境的改變，導致各種免疫細胞和免疫分子的平衡被打破，病毒本身復制也引起血管內皮損傷等組織學改變，最終導致凝血系統和抗凝系統的功能紊亂，從而促使血栓形成。我們的實驗結果一定程度上支持病毒感染可作為血栓形成危險因素的觀點，但由于實驗對象小鼠與人類循環系統有很大區別，我們對小鼠的凝血系統的組成和運作了解也還不多，所以要在動物身上復制真正病因學上的VTE模型，并驗證其發生發展的機制還有待于進一步的探索。

［1］van W issen M，Keller TT，Ronkes B，et al.Influenza infection and risk of acute pulmonary embolism［J］.Thromb J，2007，16 （5）：16.

［2］Agarwal PP，Cinti S，Kazerooni EA.Chest radiographic and CT findings in novel swine-origin influenza A（H1N1）virus（SOIV）infection［J］.AJR Am JRoentgenol，2009，193（6）：1488 -1493.

［3］Smeeth L，Cook C，Thomas S，et al.Risk of deep vein thrombosis and pulmonary embolism after acute infection in a community setting［J］.Lancet，2006，367（9516）：1075-1079.

［4］Hultman K， Blomstrand F， Nilsson M， Expression of p lasminogen activator inhibitor-1 and protease nexin-1 in human astrocytes：Response to injury-related factors［J］.J Neurosci Res，2010，88（11）：2441-2449.

［5］Harms PW，Schmidt LA，Smith LB，Autopsy findings in eight patients with fatal H1N1 influenza［J］.Am JClin Pathol，2010，134（1）：27-35.

［6］Rahbar A， S?derberg-Nauclér C. Human cytomegalovirus infection of endothelial cells triggers platelet adhesion and aggregation［J］.JVirol，2005，79（4）：2211-2220.

［7］Klein SK，Slim EJ，de Kruif MD，Is chronic HIV infection associated with venous thrombotic disease?A systematic review［J］.Neth JMed，2005，63（4）：129-136.