實驗動物運輸盒微生物指標檢測分析

張華瓊，趙 田，范方玲，羅素蘭，夏 爽，黃 麟，吳燕茹

（成都生物制品研究所，四川成都 610023）

因乙型腦炎活疫苗擴大生產，對實驗動物的需求日益增大，我們新建了隔離器車間和207車間，并將204車間的SPF金黃地鼠全部轉移到隔離器車間，隔離器車間主要是保種育種，為207車間提供種子；207車間主要是SPF金黃地鼠飼養繁殖，為乙腦疫苗生產提供10～14日齡仔鼠。另外，204車間主要生產SPF小鼠和清潔級豚鼠，供各種產品動物試驗用；而205車間則是各種動物試驗的場所。

在動物從204車間轉移到隔離器車間的過程中，獨立通氣籠盒 （individually ventilated cages，IVC）是否能確保動物未受到污染?在動物從207車間供應到乙腦生產車間以及從204車間供應到205車間的過程中，各種動物運輸盒又是否能確保動物未受到污染?帶著這樣的問題，我們開展了實驗動物運輸盒微生物指標驗證工作［1］。

運輸盒是SPF動物（或清潔動物）在不同車間之間轉運的籠具，運輸盒應具有一定的通透性，以保證其中的動物能正常呼吸，避免“出汗”或悶死；同時運輸盒經過有效的高壓滅菌后，在運輸過程中應保持良好的密閉性，微生物指標應達到預期的要求，防止外界臟空氣污染盒內動物［2］。

本試驗選用了不同規格的籠盒來做檢測和比較，其中，小IVC籠盒主要用于金黃地鼠從204車間到隔離器車間的轉移；大IVC籠盒和普通運輸盒主要用于小鼠、豚鼠從204車間到205車間的運輸；以及金黃地鼠仔鼠從207車間到乙腦活疫苗生產車間的運輸。

連續3次測試，結果顯示大、小IVC籠盒在整個實驗動物的轉運過程中微生物水平能始終保持在潔凈度C級標準內，為控制實驗動物運輸盒質量提供了一定的參考依據。

1 材料和方法

1.1 運輸盒

小IVC籠盒15個，規格（325×210×185）mm，蓋子頂部有一直徑60 mm的生命窗（帶濾膜），外觀完好，放入一個大的不銹鋼箱子中，箱子加蓋；大IVC籠盒3個，規格（500×360×280）mm，蓋子頂部有一直徑86 mm的生命窗（帶濾膜），外觀完好；甲普通運輸盒3個，規格（466×314×200）mm，不銹鋼蓋子上有2張矩形濾膜，（229×111）mm，外觀完好；乙普通運輸盒3個，規格（600×400×210）mm，塑料蓋子上有1張矩形濾膜，（402×203）mm，盒子兩側各有2張矩形濾膜，（188×66）mm，外觀完好；濾膜均為單層，材質為無紡布，可清洗、耐高壓。

1.2 沉降皿

胰蛋白胨大豆瓊脂培養基（tryptic soy agar，TSA）平皿，直徑90 mm，由本所培養基室提供。

1.3 方法

TSA平皿和高壓滅菌后的運輸盒按程序傳入204車間動物飼養間內。在飼養間內逐一打開運輸盒，放入已標記TSA平皿（小IVC籠盒1付/盒；大IVC籠盒2付/盒；普通運輸盒2付/盒），打開平皿蓋，蓋好運輸盒蓋子。將運輸盒傳出飼養間，在204車間動物待發處放置0.5 h。小 IVC籠盒的轉移：按照《SPF金黃地鼠轉移方案》，將小 IVC籠盒從204車間經車間外周道路運送到207車間電梯口；經電梯進入二樓隔離器車間，通過走廊，經清洗間傳遞窗進入隔離器室；在隔離器室，逐一將小 IVC籠盒傳入隔離器內，在隔離器內打開籠盒，蓋上沉降皿蓋，取出沉降皿。大IVC籠盒和普通運輸盒的轉移：將大IVC籠盒和普通運輸盒從204車間經車間外周道路運送到205車間（中途繞行往返3次，相當于到達病毒性疫苗一室的時間），在超凈工作臺上打開籠蓋，取出沉降皿。將培養皿送微生物實驗室培養，于（20～25）℃下倒置孵放3 d，計數菌落；再于（30～35）℃下倒置孵放2 d，計數菌落。培養皿沉降菌應小于50 cfu/4h的標準規定［3］。

2 結果

2.1 采樣時間

平皿從放入籠盒打開蓋子，到從籠盒中取出，每次時間均在1 h以上，按1 h計算；

2.2 小IVC籠盒檢測結果

連續3次對小IVC籠盒進行檢測，結果見表1。第1次試驗，各個籠盒都有不同程度長菌，1～6個/皿不等；第2、3次試驗效果較好，除一個平皿見10個菌落外，其余都為0～2個/皿；且每次檢測平均結果都小于50 cfu/4 h。

2.3 大IVC籠盒檢測結果

連續3次對大IVC籠盒進行檢測，結果見表2。試驗中各個籠盒都有不同程度長菌，0～6個/皿不等；且每次檢測平均結果都小于50 cfu/4 h。

2.4 普通運輸盒檢測結果

第1次為甲普通運輸盒，培養結果可見較多霉菌，多數在10個/皿以上，雖然細菌菌落數不多，都在5個/皿以下，但各種菌落總數平均結果都遠遠大于50 cfu/4 h。第2次改為乙普通運輸盒，檢測結果與第1次一致，說明普通運輸盒隔離保護效果不理想，故不再做第3次試驗。詳見表3。

2.5 空白對照

每次試驗都附帶3個平皿作空白對照，培養結果均未見任何菌落，表明TSA培養基本身是沒有被污染的。詳見表4。

2.6 菌落形態

IVC籠盒試驗結果均為細菌菌落，其中90％細菌的菌落為乳白色，突起，濕潤，光滑，圓形，不透明，直徑1.5～3.0 mm；10％細菌為淺黃色，突起，濕潤，光滑，圓形，不透明，直徑0.5～1.5 mm。

普通運輸盒試驗結果多見霉菌，其中80％霉菌為灰藍色，較小霉菌點，表面呈粉末狀；20％霉菌為大量絨毛狀菌絲，黃色粉末，充滿整個平皿。

表1 小IVC籠盒3次檢測結果Tab.1 Microbial test results of settling plates in small IVC cages

表2 大IVC籠盒3次檢測結果Tab.2 Microbial test results of settlingplates in large IVC cages

3 討論

在國內，動物運輸盒材料主要有紙質和塑料兩種，運輸盒上附帶的濾膜也多是單層多孔無仿布；膜面積越小，盒內污染的機會越小。本試驗僅選擇了塑料運輸盒，供大家參考。

表3 普通運輸盒2次檢測結果Tab.3 Microbial test results of settling plates in conventional trasport cages

表4 空白對照3次檢測結果Tab.4 Microbial test results of settling plates in blank controls

甲普通運輸盒帶不銹鋼蓋，蓋子上方矩形面積內密布條形孔，夾一層濾膜；乙普通運輸盒帶塑料蓋，蓋子上方和盒子兩側打孔，密布直徑2～3 mm圓孔，覆蓋一層濾膜。較大面積的濾膜讓其通透性倍增，微生物侵入的幾率也同時增加，以至沉降菌檢測結果大大超標，而且有許多霉菌，不能達到潔凈度C級標準的微生物要求。

大小IVC籠盒蓋上蓋子后，只有生命窗通過濾膜與外界相通，密閉性很好，只有在開蓋裝動物時盒子內部才全部暴露在飼養間環境中，所以沉降菌檢測結果較少，而且大都是細菌，菌落形態與飼養間環境內的沉降菌基本一致，符合C級標準的微生物要求；所以，與普通運輸盒相比較，IVC籠盒作為運輸盒更理想。

試驗中小IVC籠盒又被裝入大不銹鋼箱中，所以沉降菌檢測結果比大IVC籠盒還少；因此可以證明SPF金黃地鼠在從204車間轉運到隔離器車間時未受到污染。

試驗檢測結果中第1次普遍高于第2，3次，這可能與開蓋放平皿的熟練程度有關，第1次放入操作較慢，飼養間空氣落下菌要多些，后來動作快了，落下菌就少了。

另外，試驗中分離的細菌霉菌未進一步鑒定。是否有SPF動物要求排除的細菌；是否與飼養間環境菌、與外界空氣中微生物的種類相一致，需要進一步鑒定、比較和分析。