四氯化碳誘導大鼠肝性腦病模型的制備

劉 冀，朱建忠，隋月林，劉 鋒

（1.滄州醫學高等?？茖W校解剖學和組織胚胎學教研室，滄州 061000； 2.河北醫科大學解剖學和組織胚胎學教研室，石家莊 050017）

肝性腦病 （hepatic encephalopathy，HE）是以各種嚴重肝臟疾病所致的代謝紊亂為基礎的中樞神經系統（CNS）功能失調綜合癥，以神經精神癥狀為主，臨床表現為意識障礙、記憶學習能力下降、行為異常、昏迷，可有撲翼樣震顫，構音障礙，出現病理反射，血氨升高，特征性腦電圖異常（高幅慢波）［1］。HE是肝臟解毒功能不全和衰竭表現，發病機制尚未完全闡明。一般認為是肝細胞功能衰竭與門靜脈因手術造成的或者是自然形成的側支分流有關。主要來自腸道的多種毒性代謝產物，未被肝臟解毒、消除，經過側支進入體循環 ，透過血腦屏障而至腦部，引起大腦功能紊亂。多認為是多種因素綜合作用的結果，目前存在多種致病學說，其中氨中毒致HE學說已被廣泛接受。在實驗性肝性腦病的研究中，肝性腦病動物模型復制的方法很多，但多有其相對局限性。為此，建立合適穩定的動物模型就非常重要。然而，迄今為止尚無滿意的慢性肝功能衰竭引起HE發生的模型，通常的動物模型研究多以行為學觀察為主，缺乏可靠的定量指標和綜合性分析。為此，我們選擇四氯化碳聯合酒精自飲的方法制作慢性肝功能衰竭引起HE發生的模型，并進行多項指標的檢測和分析。

1 材料和方法

1.1 動物

健康W istar大鼠50只，3～4月齡，體重150～200 g（合格證編號1003066）。

1.2 藥品和試劑

四氯化碳（CCl4），合肥工業大學化學試劑廠；橄欖油，上?；瘜W試劑站分裝廠（將 CCl4溶于橄欖油配制40％CCl4橄欖油溶液）；食用乙醇，深圳市華昌化工有限公司；戊巴比妥鈉，上海瑞齊生物科技有限公司

1.3 儀器

Morris水迷宮，自然基因科技有限公司產品；自動生化檢測儀 （Olympus，Au560）；全自動血氨檢測儀（日本Ammonia-CheckerⅡ型）；HEL-LIGE八道生理記錄儀，日本生產（腦電圖）。

1.4 試驗方法

1.4.1 制作肝性腦病模型：雄性 W istar大鼠50只購自河北醫科大學河北省實驗動物中心，體重150～200 g，大鼠隨機分成2組即造模組和正常對照組。造模組（n=40）給予40％CCl4、橄欖油混合溶液腹部皮下注射，（CCl4∶橄欖油 =1∶2.5），5％乙醇自來水溶液自飲。首次給藥每只鼠 0.5 m L/ 100 g，以后每只0.3 mL/100 g，每周注射2次，共9周；對照組正常喂養，普通飲水，晝夜節律喂養，每周腹下注射生理鹽水2次，9周后成模。在造模過程中記錄動物體重、外觀指標、死亡率和死亡數，同時觀察行為活動狀態，特別是神經系統的功能狀態，死亡動物做完記錄后予以剔除。

1.4.2 步驟：實驗開始前所有動物均進行 Morris水迷宮測試，建立水迷宮逃避潛伏期之后按完全隨機的方法抽出10只大鼠作為正常對照組，剩余40只進入造模組，造模組大鼠按復合因素造成肝硬化的方法進行實驗，實驗第九周（肝硬化晚期）將造模組和對照組大鼠進行水迷宮測試和腦電圖（EEG）測試，記錄逃避潛伏期，并觀察腦電圖（EEG）有無肝性腦病的典型髙幅慢波。HE的納入標準：（1）模組大鼠Morris水迷宮測試值大于對照組x+2.5 s；（2） EEG測試有典型肝性腦病髙幅慢波者；（3）出現典型HE行為、情緒者。HE模型建立。

1.4.3 Morris水迷宮測試方法：將水注入直徑130 cm、高50 cm的圓形不透明水箱中，水深25 cm、水溫（26±1）℃。水中加適量奶粉使水保持不透明狀態。測試前1 d將大鼠放入水箱中進行適應性訓練。測試時，將大鼠面朝池壁置于水箱中以測量其發現水下1.5 cm處平臺（8 cm×8 cm）的能力。連續測試5 d，每天訓練兩組次，9：00和17：00時各一組次，每一組次訓練8次。觀察指標為發現并爬上平臺時間（逃避潛伏期），取每一組次的平均值進行比較。如果大鼠在120 s內沒有發現平臺，則將大鼠置于平臺上，60 s后拿離迷宮，其搜索平臺的時間記為120 s。

1.4.4 腦電圖的測試方法：大鼠在1％戊巴比妥鈉（45 mg/kg體重）腹腔麻醉下，俯臥固定，安置額枕骨間電極，鼻根部及雙耳分別接地線，用16導腦電圖機測定，并用電腦描記腦電圖，時間常數0.3，高頻濾波100 Hz。固定、調試好儀器，安裝電極，單極導聯描記，于安靜狀態下進行描記，記錄腦電圖，連續觀察10 m in，觀察振幅與頻率。振幅為波頂到波底間的垂直高度，代表腦部電位活動的大??；頻率為同一周期的腦電波在1 s內重復出現的次數。1.4.5 血液生化檢測：全部大鼠在灌注前，水合氯醛麻醉后剪開胸腔 ，用一次性注射器無菌心臟穿刺采血5 m L。其中取1 mL置于無熱原肝素管中迅速用全自動血氨分析儀測血氨 （BA）；取2 m L全血，分離血漿后以全自動生化分析儀測定丙氨酸轉氨酶 （ALT）、總膽紅素 （TBil）、尿素氮 （BUN）。1.4.6 病理檢查：取大鼠肝臟同一葉肝組織一片 ，以4％中性甲醛溶液固定，常規脫水，石蠟包埋并且片，HE染色后光鏡觀察。

1.5 檢測指標

水迷宮逃避潛伏期；EEG；生化指標；切片；動物活動情緒行為觀察。

1.6 統計學方法

應用SPSS17.0軟件對水迷宮逃避潛伏期進行單因素方差分析；血液生化應用t檢驗進行分析。

2 結果

2.1 各組大鼠Morris水迷宮測試成績

50只正常大鼠中隨機抽出10只作為對照組，與預行造模的造模組（40只）比較兩組逃避潛伏期無顯著差別（P＞0.05），具有可比性；第九周對照組潛伏期較造模前略延長，但無統計學意義，該組大鼠無一例潛伏期延長超過造模前建立的正常值x+ 2.5 s；造模組中有15只潛伏期明顯延長，超過正常x+2.5 s，且EEG出現慢波，歸入HE組，HE組潛伏期與對照組比較潛伏期明顯延長（P＜0.01）（見表1）。

2.2 各組大鼠腦電圖的變化

除1只大鼠未出現典型肝性腦病的EEG特征性外，其余實驗組大鼠EEG均出現肝性腦病所特有的髙幅慢波。（見圖1，2）

表1 Morris水迷宮潛伏期變化（±s，s）Tab.1 The changes of escape latency of Morris watermaze（±s）test.unit：second

表1 Morris水迷宮潛伏期變化（±s，s）Tab.1 The changes of escape latency of Morris watermaze（±s）test.unit：second

#P＞0.05 *P＜0.01

動物組Groups造模前Before modeling造模后第九周9 wks after modeling正常組 Normal group（10）13.02±1.14 13.57±1.36模型組 Model group（14） 14.13±1.28# 30.23±4.9*

2.3 血液生化指標

結果顯示，模型組大鼠 ALT（丙氨酸轉氨酶）、TBil（總膽紅素）、BUN（尿素氮）及 BA（血氨）水平平均比正常組明顯升高，差異分別有非常顯著性（P＜0.01），說明模型組有嚴重的肝細胞損傷和氨中毒。（表2）

圖1 正常大鼠腦電圖Fig.1 The electroencephalograph（EEG）of a normal rat

圖2 HE大鼠腦電圖Fig.2 The electroencephalograph（EEG）of a hepatic encephalopathy rat

2.4 肝病理表現

肉眼下可見模型組大鼠肝臟普遍腫大，表面較粗糙，有較粗的顆粒，暗紅色；正常組大鼠肝臟則未見異常。光鏡下觀察，正常組大鼠肝組織肝小葉結構完整 ，肝板條索狀以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝細胞無變性、壞死；模型組大鼠肝組織經 HE染色，見肝細胞溶解，彌漫性大片壞死 ，殘留肝細胞成片氣球樣變。

2.5 行為學觀察

模型組大鼠平均體重在造模過程中表現為先升高后降低（4～5周后開始下降），并逐步表現為精神不振、厭食、嗜睡、體形消瘦等。從第6周開始，部分大鼠先后表現為活動減少、嗜睡、捕捉反應、疼痛反應遲鈍等，并且已開始出現死亡大鼠。第七周大鼠多數出現精神萎靡、呆滯、活動明顯減少、步態蹣跚、自主性活動減少、捕捉反應更加明顯、疼痛反應更加遲鈍甚至消失，個別出現昏迷、死亡大鼠增多（最終死亡率為50％：20/40）。而對照組大鼠體重持續上升，活動正常。

表2 肝性腦病模型組與對照組大鼠血液生化指標的比較（±s）Tab.2 Changes of serum biochem istry parameters of the 2 groups（±s）

表2 肝性腦病模型組與對照組大鼠血液生化指標的比較（±s）Tab.2 Changes of serum biochem istry parameters of the 2 groups（±s）

注：與正常組相比 *P＜0.01。Note：vs.normal group，*P＜0.01.

組別Groups 數量 ALT（IU/L） TBiL（IU/L） BUN（mm l/L） BA（mg/L）正常組Normal 10 60±12.3 9.7±5.0 5.2±1.1 1.0±0.2模型組Model 14 1340.4±299.7* 74.8±19.6* 8.4±3.1* 4.5±2.3*

3 討論

3.1 HE大鼠模型建立的設計思路與依據

肝性腦病的發病機制至今仍不清楚，在多種學說中以氨中毒學說的研究為多，而其他可能的機制仍需要深入的、全面的研究。為此，建立合適穩定的動物模型就非常重要。肝性腦病動物模型的制作方法主要有三種：手術造模、藥物造模、藥物合并手術造模，其中手術造模用于制作急性肝衰性 HE模型，而藥物造模用于制作慢性肝功能衰竭引起HE發生的模型［2］。目前，國內外尚無成熟的慢性肝功能衰竭引起HE發生的模型，通常的動物模型研究多以行為學觀察為主，缺乏可靠的定量指標和綜合性分析。為此，我們選擇四氯化碳腹下注射聯合酒精自飲方法制作慢性肝功能衰竭引起HE發生的模型，對動物HE模型的發生進行探索，并進行多項指標的檢測和分析。一般將動物模型制作后的一段時間內出現萎靡、嗜睡、反應遲緩、自主性活動減少、共濟失調、昏迷等癥狀之一，即可診斷為 HE。有時也可輔以檢測動物腦電圖、血氨水平，以及進行組織形態學檢查（如病理或電鏡檢查）等［3］。本實驗通過對動物行為、肝病理表現、腦電圖、水迷宮測試等項指標進行觀察，結果表明 HE造模成功。本實驗模型的制作具有以下優點：（1）Morris水迷宮測試是經典的反映動物學習、記憶、認知能力的行為學實驗并且操作簡單；（2）腦電圖測試是最重要的反映神經系統和大腦功能的方法［4，5］；（3）復合因素造成實驗性肝硬化大鼠模型是成熟的造模方法，更接近人類疾病模型。所以本實驗關于HE模型的設計思路具有動物行為學和神經生理學依據，并與HE患者的診斷標準有較好的符合性，因而具有科學性。

3.2 Morris水迷宮測試的意義

Morris水迷宮（Morriswatermaze，MWM）是英國心理學家Morris于1982年設計的，最初是檢測海馬損害動物定位航行實驗的重要工具，后來作為檢驗空間、學習、記憶的實驗手段，成為行為神經科學常用的實驗室工具之一［6］?？臻g辨別性學習記憶是檢測空間定向、反應時間，視知覺和結構應用等能力，從而評價其認知水平的一種行為模式，是一類關于場景和事件的學習記憶。簡單地說，需要動物把空間方位周圍的物體作為參照物，經過反復識認，從而在其腦內將參照物同空間方位聯系起來，借助參照物來獲得辨別該空間方位的能力。建立空間辨別性學習記憶動物模型的方法較多，雖然裝置各異，但基本原理多是讓動物對利用空間信息作出正確的選擇，其中大多裝置以電擊為刺激，使動物獲知哪一方位是傷害源，從而避開，優點是簡便易行，缺點是以電擊為刺激因素，盡管其程度和時間是可控的，但畢竟是一種傷害，使動物產生應激反應，進而影響學習記憶活動。而水迷宮法是利用動物急于逃離水的本能反應為刺激，與電擊相比對動物的影響要小得多，而且該行為模型是一種空間記憶的模型，與海馬功能有關；另外，MWM在研究學習記憶的神經化學原理方面比其他幾種方法具有優勢，特別是涉及區分記憶結構缺陷的感覺、運動、動機和再現過程等方面［7］。海馬、紋狀體、基底前腦，大腦和小腦皮質等損害均可導致MWM成績下降，且該成績能反映不同腦區及不同神經遞質相互作用、整合的情況以及神經系統能量代謝的狀態。MWM檢測成為評估認知功能缺陷和神經認知功能處于何種狀態的重要方法。所以本實驗采用MWM訓練大鼠，使其獲得辨別空間方位的能力，并利用此模型來研究大鼠的學習記憶功能。本研究采用四氯化碳、酒精自飲復合因素造成的實驗性肝硬化大鼠模型，結果顯示：造模前對照組與造模組兩組潛伏期比較無顯著差別（P＞0.05），具有可比性；第九周造模組中有15只（75％）逃避潛伏期延長超過正常x+2.5 s說明此時（肝硬化晚期）這部分大鼠學習、記憶、認知力出現障礙

3.3 HE大鼠動脈血氨濃度變化的意義

正常人體內氨的生成和清除保持著動態平衡，嚴重肝病時，由于氨的來源、生成、吸收增加以及清除不足，引起血氨增加［8，9］。據 Norenberg等報道，高血氨破壞了血腦屏障的完整性［10］；McClung等發現，氨灌注使血腦屏障的微孔由7.3人擴大到8.5； Lockwood等［11］發現肝衰竭時腦對氨的滲透表面積增加。因此，推斷在外周血循環中血氨的增高可以累及腦組織，本實驗結果顯示大鼠血氨較正常組明顯增多從而證實了血氨在HE時升高，說明血氨升高是HE發病機制之一。但也有一些研究對此提出異議，首先，血氨檢測并未出現一致性升高，有個別大鼠血氨值表現為正常，其可能處于代償期內。另外也有個別樣本血氨值甚至出現顯著低于其正常值下限，提示 HE發生時未必均伴有血氨升高，提示肝性腦病的發生機制可能相當復雜，氨中毒學說或許只是諸多機制中的一個方面，很有可能還存在其他的重要機制，例如是否存在氨、硫醇和短鏈脂肪酸的協同毒性作用、是否有假性神經遞質的參與、是否存在氨基酸代謝的不平衡等機制，這一切都有待于進一步探討，所以不能僅憑血氨水平來判斷HE的發生。

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