內(nèi)皮衍生基因-1在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)

孫亞東 張景斌 王海英 馬 彥 姜春浩 邸 軍 (吉林省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，吉林 長(zhǎng)春 130021)

內(nèi)皮衍生基因-1在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)

孫亞東 張景斌 王海英 馬 彥 姜春浩 邸 軍 (吉林省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，吉林 長(zhǎng)春 130021)

目的探討甲狀腺乳頭狀癌組織中內(nèi)皮衍生基因-1(EG-1)表達(dá)的臨床意義。方法選取吉林省人民醫(yī)院2006年2月至2008年9月普外科收治的38例甲狀腺乳頭狀癌患者，另取15例良性甲狀腺疾病病例作為對(duì)照組，應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)EG-1基因水平。結(jié)果38例甲狀腺乳頭狀癌組織中有23例檢測(cè)出EG-1 mRNA的表達(dá)，陽性表達(dá)率為61%(23/38);15例甲狀腺瘤組織中有5例檢測(cè)出EG-1 mRNA表達(dá)，陽性表達(dá)率為20%(3/15)，組間比較EG-1 mRNA在甲狀腺乳頭狀癌組織的陽性表達(dá)率高于甲狀腺瘤組織(P＜0.05)。EG-1基因在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)有關(guān)(P＜0.05)，與性別、年齡無關(guān)(P＞0.05)。結(jié)論EG-1基因在甲狀腺乳頭狀癌組織中異常高表達(dá)，可能參與甲狀腺癌的發(fā)生和發(fā)展。

內(nèi)皮衍生基因-1;基因表達(dá);甲狀腺癌

調(diào)查顯示，我國甲狀腺癌發(fā)病率逐年增加〔1〕，目前對(duì)其分子發(fā)病機(jī)制的研究越來越深入，已發(fā)現(xiàn)不少基因與甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸有關(guān)〔2，3〕。以往研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮衍生基因-1(EG-1)與內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞的增生激活狀態(tài)相關(guān)〔4〕，而EG-1在甲狀腺癌組織的表達(dá)少有報(bào)道。本研究通過RT-PCR方法檢測(cè)EG-1在甲狀腺癌組織中的表達(dá)，探討其在甲狀腺癌發(fā)生和發(fā)展中的作用，為判定甲狀腺腫瘤的良惡性和生物行為提供一定指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2006年2月至2008年9月普外科收治的38例甲狀腺乳頭狀癌患者，其中男12例，女26例，年齡30～66〔平均(48±16)〕歲，均經(jīng)病理科專家確診，所有病例術(shù)前均未行放、化療。甲狀腺癌的組織學(xué)分級(jí)參照選擇性血管造影(SAG)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，SAG評(píng)分0分為I級(jí)，1分為Ⅱ級(jí)，2～3分為Ⅲ級(jí)，其中I級(jí)9例，Ⅱ級(jí)17例，Ⅲ級(jí)12例。另取15例良性甲狀腺疾病病例作為對(duì)照組。所有病例均獲取其甲狀腺組織石蠟包埋塊。

1.2 方法

1.2.1 石蠟包埋標(biāo)本RNA提取〔5，6〕取石蠟包埋標(biāo)本，切片，每片厚度4～5μm，共5～8片，將組織放入1.5 m l離心管，加入1 ml二甲苯常規(guī)脫蠟2次，盡可能清除石蠟。用100%乙醇洗滌3次后離心，除去剩余的乙醇，室溫空氣干燥15～20 min。選用Ambion公司試劑盒(Paraffin BlockRNA Isolation kit)提取RNA。依據(jù)試劑盒的工作程序?qū)⒌鞍酌窴加入組織已徹底干躁的離心管，45℃水浴110 min后加入600μl RNA提取液孵育5 min，再加入700μl酚-氯仿進(jìn)行提取，加入1μl線性丙烯酰胺混合后再加入等體積的異丙醇，混勻，－20℃孵育過夜。高速離心，移出上層物，加入75%乙醇洗滌沉淀后移出乙醇，空氣干燥后的沉淀即為所需的RNA。紫外線可見光分光光度計(jì)測(cè)定RNA含量。

1.2.2 目的RNA擴(kuò)增 應(yīng)用上海生工逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(SK2028)轉(zhuǎn)錄合成cDNA。配成20μl反應(yīng)體系，RNA模板12μl。選擇β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)做內(nèi)參照進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列為:上游 5'-ACACTGTGCCCATCTACGAGGGG-3';下游:5'-ATGAGTGAGTTGAAGGTAGTTTCGTGGAT-3'(上海生工合成);擴(kuò)增片段366 bp。目的基因EG-1擴(kuò)增引物序列為:上游5'-TGCATCTCTGGTGAGTCAGG-3';下游:5'-TGCCTCAGCTTTGTCAAGTG-3'(上海生工合成);擴(kuò)增片段246 bp。

1.2.3 RT-PCR擴(kuò)增 選用Biometra PCR儀，擴(kuò)增體系為20μl，其中模板2μl。RT-PCR后用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)成像，分析灰度密度并照相。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS10.0軟件行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 EG-1基因在甲狀腺乳頭狀癌及甲狀腺瘤的表達(dá) RTPCR擴(kuò)增產(chǎn)物為246 bp特異性條帶，以β-actin做內(nèi)參照，所有mRNA都可擴(kuò)增出366 bp的β-actin條帶。見圖1。

圖1 各組織EG-1基因RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

2.2 RT-PCR結(jié)果顯示 38例甲狀腺癌組織中有23例檢測(cè)出EG-1 mRNA的表達(dá)，EG-1 mRNA的陽性表達(dá)率為63%(24/38);15例甲狀腺瘤組織中有5例檢測(cè)出EG-1 mRNA的表達(dá)，EG-1 mRNA的陽性表達(dá)率為20%(3/15);二者相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 甲狀腺乳頭狀癌患者EG-1表達(dá)與臨床特點(diǎn)間的關(guān)系

38例甲狀腺癌組織中，8例為男性，16例為女性;年齡＜45歲11例，≥45歲13例。男性患者的EG-1陽性表達(dá)率(67%)較女性患者的EG-1陽性表達(dá)率(67%)高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);年齡＜45歲患者的EG-1陽性表達(dá)率(61%)較年齡≥45歲患者的EG-1陽性表達(dá)率(65%)低，但差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。將38例甲狀腺癌組織按組織學(xué)分級(jí)，其中I級(jí)9例，EG-1蛋白表達(dá)陽性4例(44%);Ⅱ級(jí)17例，EG-1蛋白表達(dá)陽性11例(53%);Ⅲ級(jí)12例，EG-1蛋白表達(dá)陽性9例(75%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

甲狀腺癌是常見的內(nèi)分泌腫瘤，臨床發(fā)現(xiàn)的甲狀腺結(jié)節(jié)中有5%～10%為甲狀腺癌，甲狀腺良性結(jié)節(jié)除有壓迫等不適癥狀，可不必手術(shù)，而甲狀腺癌則需盡早手術(shù)切除。因此，如何早期準(zhǔn)確地對(duì)甲狀腺結(jié)節(jié)做出定性診斷，顯得尤為重要。而在臨床研究中發(fā)現(xiàn)有些結(jié)節(jié)的性質(zhì)難以從細(xì)胞學(xué)上鑒別，隨著對(duì)腫瘤基因的深入研究，對(duì)甲狀腺癌的分子發(fā)病機(jī)制有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)〔7〕，有助于早期對(duì)甲狀腺癌做出診斷。

甲狀腺癌的演進(jìn)很大程度上依賴于血液供應(yīng)和新生血管生成，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、存活和遷移的基因可能會(huì)通過刺激血管生成而引起腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。定位于4號(hào)染色體的EG-1基因，在富含血管的組織中高表達(dá)，如胎盤、睪丸、肝臟〔8〕，與內(nèi)皮、上皮細(xì)胞的激活狀態(tài)有關(guān)。在關(guān)于EG-1基因在乳腺癌組織中表達(dá)的研究結(jié)果表明，乳腺癌組織EG-1基因表達(dá)陽性率顯著高于良性乳腺組織〔9〕。本研究證實(shí)EG-1基因在甲狀腺乳頭狀癌組織中高表達(dá)，說明EG-1基因的激活與甲狀腺癌的發(fā)生有關(guān)，而且EG-1基因的激活與甲狀腺癌的進(jìn)展有關(guān)。有研究利用siRNA干擾技術(shù)封閉EG-1基因的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)體外細(xì)胞系增殖明顯下降，異源腫瘤體積明顯減小〔10〕。目前已有學(xué)者通過體外試驗(yàn)研究證明EG-1基因過表達(dá)可激活c-Src蛋白，從而激活MAPK信號(hào)通路引起細(xì)胞的增殖或分化〔11〕。關(guān)于EG-1基因促進(jìn)甲狀腺癌發(fā)生及發(fā)展的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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11 Lu M，Zhang L，SartippourMR，etal.EG-1 interactswith c-Src and activates its signaling pathway〔J〕.Int JOncol，2006;29:1013-8.

R736

A

1005-9202(2012)12-2476-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.12.013

吉林省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.201015127)

孫亞東(1964-)，女，博士，主任醫(yī)師，主要從事內(nèi)分泌代謝病基礎(chǔ)及臨床研究。

〔2011-11-20收稿 2012-03-27修回〕

(編輯 袁左鳴)