O-去甲基文拉法辛對大鼠肝微粒體細胞色素P450酶亞型CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19 活性的影響

劉明遠 楊光遠 楊 艷 孫嚴彤 趙錦程 朱秋雙 張明遠 白 雪 楊 玉 張 波

(佳木斯大學，黑龍江 佳木斯 154007)

O-去甲基文拉法辛(ODV)，化學名稱為1-〔2-(二甲基氨基)-1-(4-苯酚)乙基〕環己醇，是抗抑郁藥文拉法辛的活性代謝物。與文拉法辛相同，ODV通過抑制5-羥色胺以及去甲腎上腺素的再攝取來治療抑郁癥、強迫癥以及焦慮癥，但副作用小，比其更安全〔1，2〕。藥物對CYP450的影響是藥物間相互作用的重要機制之一，而ODV對CYP450代謝酶活性的影響國內外文獻鮮見報道。因此，明確ODV對CYP450酶各亞型的影響對了解其與臨床其他藥物的相互作用、指導臨床合理用藥具有重要的意義。本課題組前期實驗結果表明，ODV對大鼠CYP450含量和CYP3A4活性無影響，對CYP2D6活性有抑制作用〔3〕，但未對肝微粒體亞型CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19等酶活性進行評價，可能還存在誘導或抑制作用，尚需進一步研究。本研究進一步觀察ODV對大鼠肝微粒體亞型CYP1A2、CYP2C9及CYP2C19活性的誘導和(或)抑制作用，旨在為臨床安全聯合用藥及相關實驗研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物 健康Wistar大鼠〔購自長春高新醫學動物實驗研究中心，合格證號：SCXK-(吉)2003-0004)〕，體重200 ～250 g。

1.2 主要試劑與儀器 O-去甲基文拉法辛琥珀酸鹽水合物原料藥(含量＞98%，吉林省藥物研究所);非那西丁、對乙酰氨基酚、甲苯磺丁脲、4'-羥基甲苯磺丁脲、美芬妥英、4'-羥基美芬妥英(Sigma公司);Unico uv-2100紫外分光光度計〔尤尼柯(上海)儀器有限公司〕;Agilent 1100高效液相色譜系統(美國Agilent公司);QTRAP型三重四極桿串聯質譜儀(美國Applied Biosystem公司)。

1.3 方法

1.3.1 給藥方案 健康Wistar大鼠18只，隨機分成3組，每組6只，雌雄各半。動物經禁食過夜，對照組灌胃給予生理鹽水，連續給藥7 d;ODV給藥組，灌胃給予ODV(22.90 mg/kg)，連續給藥7 d;苯巴比妥誘導組，自ODV給藥組給藥至第5天開始腹腔注射苯巴比妥鈉75 mg/kg，連續給藥3 d。

1.3.2 肝微粒體的制備 在末次給藥24 h后，拉頸椎處死動物，取出肝臟，立即置于冰冷的蔗糖溶液(0.25 mol/L，pH7.4)中清洗，剪碎，清洗至無血色;取肝重2 g，加1 ml蔗糖溶液，用組織勻漿機在冰浴中制成勻漿;4℃下離心20 min，再取上清液離心 60 min，沉淀用 Tris-HCl緩沖液(0.1 mmol/L，pH7.4)懸浮均勻，－80℃保存。

1.3.3 Lowry法檢測蛋白濃度 依據Lowry等〔4〕方法，取牛血清白蛋白配制標準溶液，測定750 nm吸收度，以蛋白濃度C對吸收度A進行線性回歸得標準曲線。用0.5 mol/L NaOH將肝微粒體樣品稀釋適當倍數后同法操作，依據標準曲線計算蛋白濃度。

1.3.4 CYP1A2活性測定 選擇非那西丁作為CYP1A2的特異性底物〔5〕，建立定量測定非那西丁代謝物對乙酰氨基酚的HPLC-MS/MS分析方法。參照文獻方法〔6〕，建立孵育體系，孵化10 min，取樣100 μl，加入到200 μl冰冷的甲醇中終止反應。500 μl的 Tris-HCl緩沖液(pH7.4)孵育體系中含 NADPH 1.0 mmol/L、KCl 10.0 mmol/L、MgCl2 10.0 mmol/L、大鼠肝微粒體蛋白1.0 mg/ml、非那西丁10.0 μmol/L，孵育體系中有機溶劑的終濃度約為0.01%。樣品經處理后，高效液相色譜串聯質譜法(樣品處理過程及色譜、質譜條件略)測定樣品中對乙酰氨基酚的含量。

1.3.5 CYP2C9活性測定 選擇甲苯磺丁脲作為CYP2C9的特異性底物〔7〕，建立定量測定甲苯磺丁脲代謝物4'-羥基甲苯磺丁脲的HPLC-MS/MS分析方法。孵化體系、反應時間及反應終止同1.3.4，甲苯磺丁脲濃度為30.0 μmol/L，孵化體系中有機溶劑的終濃度約為0.06%。樣品經處理后，高效液相色譜串聯質譜法(樣品處理過程及色譜、質譜條件略)測定樣品中4'-羥基甲苯磺丁脲的含量。

1.3.6 CYP2C19活性測定 選擇美芬妥英作為CYP2C19的特異性底物〔8〕，建立定量測定美芬妥英代謝物4'-羥基美芬妥英的HPLC-MS/MS分析方法。孵化體系、反應時間及反應終止同1.3.4，美芬妥英濃度為30.0 μmol/L，孵化體系中有機溶劑的終濃度約為0.3%。樣品經處理后，高效液相色譜串聯質譜法(樣品處理過程及色譜、質譜條件略)測定樣品中4'-羥基美芬妥英的含量。

1.4 統計學方法 使用SPSS17.0進行統計分析，計量資料采用s表示，組間比較用t檢驗。

2 結果

分別以各探針藥物的代謝產物對乙酰氨基酚、4'-羥基甲苯磺丁脲及 4'-羥基美芬妥英 的 產率 (單位：nmol·mg protein－1·min－1)作為 CYP1A2、CYP2C9 及 CYP2C19 酶活性指標。ODV給藥組與對照組大鼠肝微粒體 CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19活性差異均無統計學差異(P＞0.05)，見表1。說明ODV對CYP1A2、CYP2C9及CYP2C19亞型活性沒有抑制或誘導作用。

表1 對照組、ODV組CYP1A2、CYP2C9及CYP2C19活性(nmol·mg protein －1·min－1，s)

表1 對照組、ODV組CYP1A2、CYP2C9及CYP2C19活性(nmol·mg protein －1·min－1，s)

6 0.106±0.05 0.118±0.05 0.025±0.01 ODV給藥組CYP1A2 CYP2C9 CYP2C19對照組組別 n 6 0.124±0.05 0.100±0.05 0.021±0.01

3 討論

多種藥物合用時，在藥物的吸收、分布、代謝、排泄四個階段均可能發生藥物間相互作用，兩種藥物同時使用的潛在藥物相互作用發生率為6%，五種藥物為50%，八種藥物增至100%，其中代謝性相互作用發生率最高，具有非常重要的臨床意義。CYP450酶系是重要的藥物代謝酶，在外源性化合物(包括藥物和毒物)的生物轉化中起著十分重要的作用，其活性決定藥物的代謝速率，與藥物的清除率有著直接關系，是造成代謝性藥物相互作用的主要原因。老年人常多病共存，多藥共服，更容易發生藥物間相互作用。由于老年人抑郁癥高發，抗抑郁藥與其他藥物合用在老年人中較為常見。而ODV具有極高的抗抑郁活性和耐受性，臨床常用于抑郁癥的治療，因此，研究ODV對CYP450活性的影響也顯得非常重要。

CYP450酶根據其氨基酸序列不同分為不同亞型，人體主要有五種 CYP450 酶，即 CYP1A2、CYP2D6、CYP3A4、CYP2C9和CYP2C19。這五種細胞色素P450酶可以代謝約99%的通過細胞色素P450酶代謝的藥物〔9〕。本課題組前期試驗結果表明，ODV對大鼠 CYP450含量和 CYP3A4活性無影響，對CYP2D6活性有抑制作用。為了更全面掌握ODV對肝細胞色素P450酶的作用，本試驗進一步探討了ODV對肝微粒體CYP450酶CYP1A2、CYP2C9及CYP2C19活性的影響。

本試驗以22.90 mg/kg體重(相當于人體推薦用量)的劑量給予大鼠ODV原料藥，連續給藥7 d，測定了ODV直接給藥對大鼠CYP1A2、CYP2C9及CYP2C19活性的影響。結果顯示，Wistar大鼠經過ODV處理后，與對照組比較，CYP1A2、CYP2C9及CYP2C19活性均沒有變化，說明 ODV對大鼠 CYP1A2、CYP2C9及CYP2C19沒有抑制或誘導作用，提示當ODV與某些主要經CYP1A2、CYP2C9及CYP2C19代謝的藥物合用時，發生代謝性藥物相互作用的可能性較小。

ODV口服給藥后對 CYP450酶 CYP1A2、CYP2C9及CYP2C19的影響目前尚未見文獻報道，本實驗采用大鼠口服給藥后肝微粒體體外孵育法，分別以非那西丁、甲苯磺丁脲及美芬妥英為CYP1A2、CYP2C9及CYP2C19的特異性底物，通過代謝產物的生成速度來評價酶的活性。這種方法的優點是重現性好，肝微粒體制備容易，勻漿易保存，孵育條件易優化。但藥物對CYP450酶的抑制或誘導作用存在一定的種屬差異〔10〕。ODV對人肝微粒體CYP450酶各亞型的作用，還有待進一步研究證實。

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