PDE4D基因多態性與遼寧省漢族人群缺血性腦卒中的相關性

李 楠 何志義 (錦州市中心醫院神經內科，遼寧 錦州 200)

PDE4D基因多態性與遼寧省漢族人群缺血性腦卒中的相關性

李 楠 何志義1(錦州市中心醫院神經內科，遼寧 錦州 121001)

目的探討磷酸二酯酶(PDE)4D基因多態性與遼寧省漢族人群缺血性腦卒中(IS)潛在的遺傳發病機制分子流行病學依據。方法 采用病例對照的研究方法，檢測PDE4D基因多態性位點SNP83、SNP 87、SNP219和SNP220在病例組、對照組中的頻率分布。結果病例組SNP83位點CC基因型和C等位基因型頻率分布均高于對照組(CC:P=0.001;OR=1.788;95%CI:1.280～2.497;C:P=0.003;OR=1.368;95%CI:1.115～1.678)。SNP219位點AA基因型和A等位基因型頻率高于對照組(AA:P=0.029;OR=1.444;95%CI:1.037～2.010;A:P=0.048;OR=1.228;95%CI:1.001～1.505)。經條件Logistic回歸校正后，SNP83CC基因型分布頻率仍然高于對照組(P=0.036;OR=1.603;95%CI:1.032～2.489)，SNP219AA基因型分布頻率也仍然高于對照組(P=0.046;OR=1.567;95%CI:1.008～2.436)。由SNP219、SNP220位點構建的單體型中，AA單體型頻率病例組高于對照組(P=0.013;OR=1.296;95%CI:1.056～1.591)。GA單體型頻率病例組低于對照組(P=0.005;OR=0.650;95%CI:0.482～0.878)。結論PDE4D基因SNP83、SNP219位點可能與遼寧省漢族人群大血管性IS具有相關性，而在由SNP219、SNP220位點構建的單體型中，AA可能是危險性單體型，GA可能是保護性單體型。

缺血性卒中;磷酸二酯酶4D;基因型;單體型

缺血性腦卒中(IS)目前被認為是由遺傳因素與環境因素相互作用所致的復雜性疾病，而遺傳因素在其發病機制中起著重要的作用。磷酸二酯酶(PDE)4D基因于2003年被冰島的deCODE遺傳學研究組發現與IS具有密切相關性〔1，2〕。該基因定位于人類常染色體5q12，編碼產物為環核苷PDE，主要存在于各種炎性細胞內，能夠選擇性降解第二信使環磷酸腺苷(cAMP)。cAMP在信號轉導和諸多生理學反應中發揮關鍵作用，其水平的降低可以導致血管平滑肌細胞的增殖和遷移，這是動脈粥樣硬化的主要過程之一，而腦動脈粥樣硬化目前被公認為是IS的發病基礎。由此可以推測該基因可能與腦卒中的病理生理機制相關。在deCODE研究組發現PDE4D基因后，其他一些針對不同的人群進行的一系列相關研究，驗證該基因與IS之間是否具有確切的相關性，目前國內外的研究結果大相徑庭〔3～12〕。目前國內該方面的資料尚不完善。因此，本課題立足于遼寧省漢族人群，探討PDE4D基因多態性與IS之間的關系，以期為探尋該病的易患基因提供一定的分子遺傳學方面的證據。

1 資料與方法

1.1 受試對象 病例組所有IS病人選自2009年12月至2011年1月于中國醫科大學附屬第一醫院、盛京醫院、遼寧省人民醫院、錦州市中心醫院神經內科住院的患者，共計371例，年齡41～74〔平均(63.88±7.36)〕歲，均屬遼寧漢族人群，男230例，女141例，彼此無親緣關系。全部病例經詳細詢問病史、體格檢查以及參照頭部CT或MRI檢查結果，均符合國際疾病分類第 9版(ICD9)的 IS診斷標準，均屬于 IS分型(TOAST)中的大血管性IS。排除標準包括:腦出血、腦栓塞、蛛網膜下腔出血、膠原病、血管炎性疾病所致腦梗死、腦淀粉樣血管病、動靜脈畸形。對照組371例，選自上述醫院體檢中心的健康體檢者或其他臨床科室無遺傳性疾病、無神經系統疾病及無急慢性炎癥的住院病人，男247例，女124例，年齡42～72〔平均(62.87±7.57)〕歲，彼此之間無血緣關系。兩組在年齡、性別構成及罹患高膽固醇血癥的數量方面無顯著差異(P＞0.05)，病例組患高血壓、糖尿病及吸煙者的數量與對照組相比顯著增高(P＜0.05)。見表1。在課題開始前，所有受試者均簽署知情同意書，并報請各醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 DNA的制備 以Promega公司基因組DNA提取試劑盒提取所有受試者的基因組DNA，檢測其純度和濃度后，置于－20℃冰箱中保存備用。

1.2.2 單核苷酸多態性(SNPs)的選擇 選取deCODE研究組在冰島人群中證實與IS相關的PDE4D基因多態性位點SNP83、SNP 87、SNP219 和 SNP220 展開研究。

1.2.3 SNP83和SNP87位點的檢測 利用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)技術對這兩個位點進行檢測，應用Primer5.0軟件進行引物設計，具體引物序列、限制性核酸內切酶的種類以及反應條件見表2。

酶切結果的判定:經限制性核酸內切酶Tail消化后，含有C等位基因型的SNP83位點可以被Tail酶切為264、95 bp兩條電泳條帶，如果酶切結果含有264、95 bp兩條電泳條帶，則可以判定為C/C型純合子，如果酶切結果只有359 bp一條電泳條帶則可以判定為T/T型純合子，如果酶切結果為264、95、359 bp三條電泳條帶則判定為C/T型雜合子。見圖1。

經限制性核酸內切酶SSPⅠ消化后，SNP87位點含有T/T等位基因型的純合子可以被限制性核酸內切酶SSPⅠ切為264、222 bp兩條電泳條帶，T/C型雜合子為486、264和222 bp三條電泳條帶，C/C型純合子為486 bp一條電泳條帶。見圖2。

表1 病例組和對照組受試者的基本資料〔n(%)〕

表2 引物序列、限制性核酸內切酶的種類以及反應條件

1.2.4 基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜引物延伸(MALDI-TOF-PEX)技術檢測 PDE4D基因 SNP219、SNP220位點多態性 PCR引物和單堿基延伸引物均采用Assay Designer(Sequenom)軟件包設計。

SNP219引物:前向:5'-ACGTTGGATGGCACTCAGGTTAAATCTACCA-3';反 向:5'-ACGTTGGATGCTAATGACTTTTGTTCAACTG-3';延伸引物為:5'-TGTTCAACTGTATCACTCT-3'。

SNP220引物:前向:5'-ACGTTGGATGTGGTGAGCACAATCCTTGAG-3';反向:5'-ACGTTGGATGTTCCCTTGGGTGGAAAACT C-3';延伸引物為:5'-CTCCTCTCTCTGTTCCT-3'。MALDI-TOFPEX技術鑒定多態性位點基因型步驟如下:第一步為PCR擴增反應;第二步應用堿性磷酸酶將PCR擴增后，剩余的dNTP消化掉;第三步為單堿基引物延伸反應;最后進行質譜儀點樣分析。最終結果由MassARRAY RT軟件系統(版本號3.0.0.4)實時讀取，并由MassARRAY Typer軟件系統(版本號3.4)完成基因分型分析。

結果判定:當SNP219位點等位基因為A時，特異性引物延伸一個dA堿基，等位基因為G時，特異性引物延伸一個dG堿基，因此如果待測樣本為AA型純合子，引物延伸可見到一個A信號峰;如果為AG型雜合子，可見到一個A信號峰和一個G信號峰;如果為GG型純合子，可見到一個G信號峰。同理，當SNP220位點等位基因為A時，特異性引物延伸一個dA堿基，等位基因為C時，特異性引物延伸一個dC堿基，因此如果待測樣本為AA型純合子，引物延伸可見到一個A信號峰;如果為AC型雜合子，可見到一個A信號峰和一個C信號峰;如果為CC型純合子，可見到一個G信號峰。見圖3。

1.3 統計學分析 采用SPSS11.0軟件分析，計數資料采用χ2檢驗，多因素分析采用Logistic回歸。

圖1 SNP83位點經Tail酶切后電泳圖

圖2 SNP87位點經SSPⅠ酶切后電泳圖

圖3 1例樣本經MALDI-TOF-PEX技術檢測后的峰圖

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗 病例組和對照組的SNPs位點基因型頻率分布沒有偏離Hardy-Weinberg平衡。所以，本研究選擇的研究人群基因頻率能夠代表群體的基因分布。

2.2 基因型和等位基因型頻率比較 PDE4D基因SNP83位點的CC型純合子基因型頻率與對照組相比具有顯著差異(P=0.001，OR=1.788;95%CI:1.280～2.497)，提示其與大血管性IS具有顯著相關性。SNP 219位點AA基因型頻率高于對照組(P=0.029，OR=1.444;95%CI:1.037 ～2.010)。而其他位點的基因型頻率在病例組和對照組之間并未發現統計學差異。見表3。

經條件Logistic回歸校正，排除傳統危險因素(高血壓、糖尿病、吸煙、高膽固醇血癥等)影響后，SNP83CC基因型分布頻率仍然高于對照組(P=0.036;OR=1.603;95%CI:1.032～2.489)，SNP219AA基因型分布頻率也仍然高于對照組(P=0.046;OR=1.567;95%CI:1.008～2.436)。見表4。

表3 病例組與對照組基因型分布〔n(%)〕

表4 SNP83CC基因型與SNP219AA基因型條件Logistic回歸校正結果

PDE4D基因SNP83位點C等位基因頻率顯著高于對照組，當個體攜帶C等位基因時，其患大血管性IS的風險率增加至1.368倍(OR=1.368;95%CI:1.115～1.678;P=0.003)。SNP219A等位基因頻率顯著高于對照組，當個體攜帶A等位基因時，其患大血管性IS的風險率增加至1.228倍(OR=1.228;95%CI:1.001～1.505;P=0.048)，而其他位點等位基因頻率在病例組與對照組間未見統計學差異。見表5。

2.3 病例組與對照組PDE4D基因單體型頻率比較 本研究分別在PDE4D基因SNP83與SNP87位點之間和SNP219與SNP220位點之間構建單體型，應用SHEsis軟件計算各單體型在病例組與對照組之間的頻率分布，并進行比較。結果顯示:SNP83與 SNP87位點之間組成的單體型(D′=0.641，r2=0.502)在病例組和對照組的分布頻率并無顯著性差異，而SNP219與SNP220之間構建的AA單體型在病例組的頻率分布高于對照組，GA單體型在對照組的頻率分布高于病例組(D′=0.707，r2=0.369)。見表6，表7。

表5 病例組與對照組PDE4D基因等位基因頻率比較〔n(%)〕

表6 病例組與對照組PDE4D基因單體型頻率(%)比較(SNP83與SNP87)

表7 病例組與對照組PDE4D基因單體型頻率(%)比較(SNP219與SNP220)

3 討論

IS易感基因的確定是一個極其復雜的過程，單個基因與IS之間的關系研究結論不一。本研究中確定了371例大血管性IS患者和371例健康對照者的 PDE4D基因 SNP83、SNP87、SNP219和SNP220位點的基因型與等位基因型，分別計算出了在病例組與對照組的頻率分布，并進行了分析比較。結果發現病例組SNP83位點CC基因型、C等位基因型以及SNP219 AA基因型、A等位基因型的分布頻率明顯高于對照組，這與Saleheen 等〔4～7，11〕的研究結果一致，提示 SNP83、SNP219 位點可能是我國北方漢族人群IS的特異性變異位點，是我國北方漢族人群的易感基因型和易感等位基因型，目前在國內尚無該方面的報道。而其他位點的基因型與等位基因型的分布頻率在病例組和對照組間并無統計學差異，這一結果與Gretarsdottir等〔2〕的結果不一致。這一差異提示，某種基因多態性與疾病之間的關系可能受到地域、種族的影響，不能因為這種基因多態性在某一國家或地區與某種疾病具有或不具有相關性而輕率作出這種基因是或不是這種疾病的易感基因的論斷，甚至在同一國家內部，也應該針對不同地區、不同民族的人群進行分門別類的研究。

在本研究中，并未發現在由SNP83、SNP87組成的單體型在病例組和對照組之間存在分布頻率的差異。推測其中的原因，一方面可能是因為種族的差異導致了研究結果的不同。另一方面可能是由于本研究的樣本量有限所致，因此有必要在后續的研究中繼續擴大研究規模。不過，在本研究中也發現，由SNP219與SNP220之間構建的AA單體型在病例組的頻率分布高于對照組，提示其可能是一種危險性單體型，這種單體型攜帶者罹患大血管性IS的風險可能會顯著增加;GA單體型在對照組的頻率分布高于病例組，提示其可能是一種保護性單體型，這種單體型攜帶者罹患IS的風險可能會降低。

本研究還分別檢測了病例組、對照組中合并高血壓、糖尿病、高膽固醇血癥等傳統危險因素以及有吸煙史者的比例，發現病例組合并高血壓、糖尿病以及有吸煙史者的比例顯著高于對照組，這與上述因素與IS密切相關的傳統觀點是一致的。不過，一個有趣的現象是，病例組中合并高膽固醇血癥者的比例與對照組人群并無明顯差異，這似乎與傳統觀點相悖。之所以出現這種情況，一方面可能與亞洲人群食品結構中高膽固醇食物含量較少有關，另一方面也可能與本研究所選擇的樣本量相對較小有關。

綜上所述，PDE4D基因SNP83、SNP219位點可能與遼寧省漢族人群大血管性IS具有相關性，在由SNP219、SNP220位點構建的單體型中，AA可能是危險性單體型，GA可能是保護性單體型。但還有待大規模的研究證實。

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R743

A

1005-9202(2012)12-2508-05;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.12.030

遼寧省教育廳2006～2007年度高等學校科研項目計劃資助項目(No.20060981)

1 中國醫科大學附屬第一醫院神經內科

何志義(1961-)，男，教授，主任醫師，主要從事腦血管病基因診治研究。

李 楠(1974-)，男，博士，副主任醫師，主要從事腦血管病基因診治研究。

〔2011-11-05收稿 2012-03-10修回〕

(編輯 袁左鳴)