銀杏葉提取物對(duì)大鼠局灶性腦缺血-再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用

王淑英 斗 章 姜曉藝 王景霞 李 堯 李 文 齊亞靈

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

銀杏葉提取物對(duì)大鼠局灶性腦缺血-再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用

王淑英 斗 章1姜曉藝2王景霞 李 堯 李 文 齊亞靈

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

目的研究銀杏葉提取物(EGB)對(duì)大鼠局灶性腦缺血-再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。方法采用改良線栓法建立大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞腦缺血-再灌注模型。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、EGB治療組。觀察局灶性腦缺血2 h再灌注24 h后，大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分及神經(jīng)元的變化。結(jié)果再灌注24 h后，與單純?nèi)毖?再灌注組相比，給予EGB溶液注射可以改善動(dòng)物的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、減輕神元損傷。結(jié)論EGB對(duì)大鼠局灶性腦缺血-再灌注損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用。

局灶性腦缺血-再灌注;銀杏葉提取物;神經(jīng)保護(hù)

腦缺血后如何保護(hù)腦功能，減輕缺血-再灌注損傷，尋找腦梗死防治的方法，已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)〔1，2〕。近年來EGB對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)作用有大量的研究，表明EGB對(duì)CNS的保護(hù)作用明顯，對(duì)正常個(gè)體增強(qiáng)記憶功能和促智也有一定的作用，但EGB對(duì)腦缺血-再灌注后神經(jīng)元損傷的影響機(jī)制少見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠局灶性腦缺血-再灌注模型，觀察EGB對(duì)大鼠局灶性腦缺血-再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康Wistar大鼠75只，體重280～380 g，雌雄不限，隨機(jī)分為3組。動(dòng)物由佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物術(shù)前12 h禁食，可自由飲水。

1.2 動(dòng)物分組 將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組:25只，做動(dòng)脈分離手術(shù)，不栓塞大腦中動(dòng)脈;缺血-再灌注組(I/R組):25只，大腦中動(dòng)脈栓塞2 h，再灌注24 h;EGB干預(yù)組:25只，對(duì)其進(jìn)行大腦中動(dòng)脈栓塞 2 h，栓塞后 2 min內(nèi)尾靜脈注射 EGB(20 mg/kg)，再灌注24 h，其間給藥3次。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的制備及干預(yù) 采用頸內(nèi)動(dòng)脈插線栓法造模。Wistar大鼠用3.5%水合氯醛(350 mg/kg，腹腔注射)麻醉，仰臥固定。切開頸部正中皮膚，鈍性游離右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，仔細(xì)分離避免刺激迷走神經(jīng)。由CCA分叉處向頭端依次游離，并用電熱燒灼器燒斷頸外動(dòng)脈所有分枝，使其主干游離備用。然后分離ICA至顱底，并分離出ICA顱外段的唯一分支翼腭動(dòng)脈(PPA)。用蛙心夾夾住CCA和ICA，并在ECA(靠近CCA分叉處)上剪一小口，將一端涂有聚氨酯的栓子(預(yù)先蘸有肝素鈉溶液)沿切口插入ECA，經(jīng)CCA分叉處并將預(yù)先放置于ECA根部的手術(shù)縫合線扎緊，防止其中的栓子滑出和出血，然后放開ICA上的蛙心夾，將栓子緩慢地向ICA入顱方向推進(jìn)約19～21 mm，待微遇阻力即停，使栓子頭端停留在大腦中動(dòng)脈(MCA)與大腦前動(dòng)脈(ACA)分叉處。栓子固定，即完成了一側(cè)MCA的栓塞。栓塞2 h后，緩慢的輕拉栓子使其頭端回到ECA內(nèi)，即可實(shí)現(xiàn)MCA的再灌注。假手術(shù)組除不插線外，全過程與模型組相同。術(shù)后2 min尾靜脈給藥，20 mg/kg，每天3次，假手術(shù)組和模型組給予相等體積生理鹽水。各組大鼠均在再灌注24 h后取材。

1.4 神經(jīng)病學(xué)評(píng)分 動(dòng)物清醒以后分別在對(duì)應(yīng)時(shí)點(diǎn)進(jìn)行評(píng)分，標(biāo)準(zhǔn)如下:0級(jí):無缺陷，活動(dòng)正常;Ⅰ級(jí):右側(cè)Horner征陽(yáng)性;Ⅱ級(jí):提尾懸空時(shí)左前肢屈曲、內(nèi)收;Ⅲ級(jí):自主運(yùn)動(dòng)時(shí)向偏癱側(cè)(左側(cè))劃圈。腦缺血后，上述Ⅰ～Ⅲ級(jí)三項(xiàng)體征均出現(xiàn)的大鼠，才可視為造模成功，進(jìn)入下一步試驗(yàn)。

1.5 病理學(xué)觀察 電鏡標(biāo)本再灌注24 h后，將動(dòng)物斷頭取右腦，修成 1 mm×1 mm×1 mm小塊，用 2.5%戊二醛的0.1 mol/L磷酸緩沖液固定，丙酮梯度脫水、環(huán)氧樹脂浸透包埋，超薄切片，厚50 nm，醋酸鈾染色鏡下觀察線粒體及核膜變化。

1.6 超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的測(cè)定 大鼠腦缺血-再灌注至24 h后，迅速斷頭取右腦，在冰盤中以腦組織(mg)∶生理鹽水(m l)=10∶1的比例，在盛有冰塊的器皿中用玻璃勻漿器碾磨成腦勻漿，離心20 min，取上清液放置在－30℃以下保存待測(cè)。采用黃嘌呤氧化酶發(fā)光法檢測(cè)SOD。用硫代巴比妥酸法(TAB)測(cè)定MDA。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用SPSS軟件處理，組間采用方差分析，組內(nèi)采用獨(dú)立樣本檢驗(yàn)。所有結(jié)果以±s表示。

2 結(jié)果

2.1 大鼠缺血-再灌注組和EGB干預(yù)組神經(jīng)病學(xué)評(píng)分 見表1。假手術(shù)組體征無變化;缺血2 h內(nèi)，大鼠體征表現(xiàn)為右側(cè)Horner征陽(yáng)性，提尾時(shí)左前肢屈曲、內(nèi)收，爬行時(shí)向左劃圈，再灌注后24 h、大鼠體征仍表現(xiàn)為Horner征陽(yáng)性，提尾時(shí)左前肢屈曲、內(nèi)收，爬行向左劃圈;EGB干預(yù)組神經(jīng)病學(xué)評(píng)分較I/R組有明顯改善，缺血2 h再灌注24 h EGB干預(yù)組44%大鼠評(píng)分由Ⅲ級(jí)轉(zhuǎn)為Ⅱ級(jí)或Ⅰ級(jí)。

2.2 組織病理學(xué)觀察 假手術(shù)組神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)線粒體較多，呈圓形或橢圓形，內(nèi)嵴排列整齊、清晰，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)散在分布，表面有核糖體密集附著，核膜結(jié)構(gòu)完整;缺血2 h再灌注24 h，電鏡下神經(jīng)元內(nèi)細(xì)胞器明顯減少，胞漿內(nèi)線粒體腫大，嵴變短或減少、消失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)也擴(kuò)張，其上的核糖體脫失，胞漿中糖原減少，自噬泡增多，核膜不完整或缺失;EGB干預(yù)組核膜結(jié)構(gòu)與正常組無明顯差別，線粒體有輕度腫脹，與缺血-再灌注組比較明顯減輕(圖1)。

2.3 SOD和MDA水平的變化 見表2。I/R組SOD明顯降低，MDA明顯升高(P＜0.05)，EGB干預(yù)后SOD、MDA均明顯改善(P＜0.05)。

表1 各組大鼠神經(jīng)病學(xué)評(píng)分(n)

表2 大鼠SOD和MDA水平的變化(±s，n=25)

表2 大鼠SOD和MDA水平的變化(±s，n=25)

與假手術(shù)組比較:1)P＜0.05;與I/R組比較:2)P＜0.05

組別 SOD(U/mg) MDA(nmol/mg)191.17±19.15 1.12±0.06 I/R組 87.48±16.671) 2.02±0.871)EGB干預(yù)組 150.75±8.951)2) 1.20±0.211)2)假手術(shù)組

圖1 各組大鼠神經(jīng)元線粒體電鏡圖像(×20 000)

3 討論

銀杏作為藥用植物使用由來已久，在宋朝時(shí)就已開始用銀杏葉治療哮喘和支氣管炎。有實(shí)驗(yàn)表明，EGB對(duì)高血壓、冠心病、動(dòng)脈硬化、心絞痛、腦功能減退、老年性記憶減退、老年性癡呆、衰老等與心腦血管循環(huán)有關(guān)的疾病有顯著的預(yù)防和治療效果〔3，4〕。這些研究多集中在動(dòng)物神經(jīng)行為學(xué)的改善或藥物依賴中的相互作用，而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理?yè)p傷中的研究較少。

線粒體是細(xì)胞內(nèi)的能量生成和儲(chǔ)存的主要場(chǎng)所，對(duì)缺血缺氧非常敏感。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)部和線粒體基質(zhì)中有完善的抗氧化防御體系，如SOD及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等;抗氧化劑如VitC、VitE以及機(jī)體自身的調(diào)控機(jī)能如脂酶、DNA修復(fù)酶、蛋白酶、酰基轉(zhuǎn)移酶等，體內(nèi)自由基處于生成和清除的平衡狀態(tài)中，不損害機(jī)體。腦缺血時(shí)線粒體被破壞，不能進(jìn)行有氧氧化，線粒體ATP產(chǎn)生不足，再灌注時(shí)血液突然增加帶入的氧只能在蛋白激酶C、髓過氧化物酶、黃嘌呤氧化酶等酶催化生成主要包括超氧化物陰離子(O－2)、單線態(tài)氧(O2)、過氧化氫(H2O2)、氫氧根(OH－)和氫過氧基(HO－2)等，并使缺血期因氧耗竭而停止的烷自由基向脂質(zhì)過氧化自由基的轉(zhuǎn)化得以延續(xù)，從而產(chǎn)生一些脂類過氧化中間產(chǎn)物，大量增加的氧自由基(ROS)超出了SOD、GSH-Px等的防御清除能力〔5〕，超量的 ROS攻擊線粒體抗氧化酶及自由基清除酶，自由基產(chǎn)生急劇增多，形成惡性循環(huán)，過剩的ROS攻擊線粒體膜磷脂中不飽和脂肪酸雙鍵而導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，MDA含量增加，MDA是自由基引起不飽和脂質(zhì)過氧化作用的特征產(chǎn)物。由于神經(jīng)組織具有很高的氧化代謝水平及含有豐富的高密度不飽和脂肪酸，特別易受自由基攻擊造成損傷，同時(shí)產(chǎn)生的MDA使大分子物質(zhì)交聯(lián)，細(xì)胞功能喪失，進(jìn)一步引起腦損傷。

本研究結(jié)果表明EGB可以改善缺血-再灌注后的腦組織病理變化，能較明顯改變線粒體的呼吸狀態(tài)，使線粒體磷酸化水平提高，ATP合成增加，一定程度上恢復(fù)了腦線粒體正常形態(tài)和功能，從而保護(hù)腦細(xì)胞。

1 陳芬芳，湯永紅.Bcl-2與腦缺血-再灌注損傷關(guān)系的研究進(jìn)展〔J〕.醫(yī)學(xué)信息(上旬刊)，2011;24(2):821-2.

2 黃昕艷，張道春，陳 麗.納洛酮對(duì)大鼠局灶性腦缺血-再灌注損傷后的腦保護(hù)作用〔J〕.心血管康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2008;17(2):162-4.

3 吳宗群，李廣平，冷愛晶.銀杏葉提取物的藥理作用〔J〕.中國(guó)藥師，2006;9(12):209-13.

4 王 琛，李昌煜.銀杏葉提取物藥理作用研究新進(jìn)展〔J〕.2009;11(3):10-2.

5 仇萬山，陳亦江.線粒體結(jié)構(gòu)、功能和常用研究方法〔J〕.國(guó)際麻醉學(xué)與復(fù)蘇雜志，2007;28(3):282-5.

Neuroprotection of extract of Ginkgo biloba on the focal cerebral ischem ia-reperfusion injury of rats

WANG Shu-Ying，DOU Zhang，JIANG Xiao-Yi，et al.
Basic M edical College of Jiam usi University，Jiamusi154007，Heilongjiang，China

ObjectiveTo investigate the protective effect of extract of Ginkgo biloba(EGB)on focal cerebral ischemia reperfusion(I/R)injury in rats.MethodsWistar ratswere random ly divided into sham，ischemia-reperfusion and treated by EGB groups.Ratmiddle cerebral I/R injurymodelwas established with suture embolimethod for120minutes.The neurobehavioral scores，neuron injurewere evaluated at24 hours of reperfusion.ResultsAfter 24 hours of reperfusion，EGB injection improved neurological outcome and reduced neuron injury.ConclusionsEGB can have neuroprotection against I/R injury.

Focal cerebral ischemia-reperfusion;Extract of Ginkgo biloba;Neuroprotection

R749

A

1005-9202(2012)12-2539-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.12.044

黑龍江省教育廳科研項(xiàng)目(11541359);黑龍江省衛(wèi)生廳科研項(xiàng)目(2009-353);佳木斯大學(xué)科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(S2009-072)

1 佳木斯大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院 2 佳木斯大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院

齊亞靈(1967-)，女，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事神經(jīng)損傷與修復(fù)及腫瘤分子生物學(xué)方面的研究。

王淑英(1974-)，女，副教授，碩士，主要從事神經(jīng)損傷研究。

〔2012-01-10收稿 2012-03-25修回〕

(編輯 曹夢(mèng)園)