卡托普利預處理對急性心肌損傷大鼠CT-1mRNA和gp130 mRNA表達的影響及意義

顧 明 馬鴻雁 李玉芹 車兆梅 于維漢 (北華大學附屬醫院心內科，吉林 吉林 320)

卡托普利預處理對急性心肌損傷大鼠CT-1mRNA和gp130 mRNA表達的影響及意義

顧 明 馬鴻雁 李玉芹 車兆梅 于維漢1(北華大學附屬醫院心內科，吉林 吉林 132011)

目的研究心肌營養素1(CT-1)及其受體gp130在異丙基腎上腺素(Iso)致大鼠急性心肌損傷中的保護作用。方法將Wistar雄性大白鼠隨機分為3組:對照組、Iso損傷組，卡托普利(Cap)預處理組;用光鏡觀察心肌組織的病理變化，用生化方法檢測心肌酶，用RT-PCR方法檢測心肌組織CT-1 mRNA、gp130 mRNA的表達。結果Cap預處理組與Iso損傷組比較，心肌壞死面積減小，肌酸激酶(CK)、谷氨酸氨基轉移酶(GOT)、乳酸脫氫酶(LDH)降低，CT-1 mRNA和gp130 mRNA表達增高(P＜0.01，P＜0.05)。結論Cap預處理可能通過促進CT-1的表達保護心肌。

異丙基腎上腺素;卡托普利;心肌營養素1;心肌;大鼠

心肌營養素1(CT-1)屬白細胞介素-6(IL-6)家族成員。CT-1與其特異性受體人糖蛋白(gp130)結合后，可促進未成熟心肌細胞的存活和增殖，具有心肌保護作用〔1〕?？ㄍ衅绽?Cap)則可通過缺血預適應減輕心肌損傷〔2〕。本實驗通過給大鼠腹腔注射異丙基腎上腺素(Iso)，建立了急性心肌損傷的動物模型，其病理特點、電生理等變化與缺血型心臟病類似。本文首次探討了血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)的心肌保護作用是否與CT-1及其受體gp130的表達上調有關，從而為臨床上如何干預CT-1的表達提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及預處理 健康雄性Wistar大鼠60只，體重180～200 g(由哈爾濱醫科大學動物實驗中心提供)，均食用普通飼料，飲普通水。將實驗動物隨機分為三組:Iso損傷組(n=20);Cap預處理組(n=20);生理鹽水對照組(n=20)。Iso損傷組:腹腔注射 Iso 5.0 mg/kg，1次/d，連續3 d，注射前一天生理鹽水3 m l灌胃，連續3 d;Cap預處理組:腹腔注射Iso，方法同Iso損傷組，卡托普利100 mg/kg灌胃，連續3 d;對照組:等劑量的生理鹽水注射及灌胃。末次注藥后24 h處死動物，按實驗要求取材。

1.2 心肌組織病理學分析 取心肌標本制作石蠟切片，HE染色后觀察形態學改變。心肌損傷程度用北京航空航天大學真彩色病理圖像分析系統測量心肌壞死灶面積和心肌總面積，并計算二者的百分比。

1.3 血清心肌酶測定 用全自動生化分析儀測定肌酸激酶(CK)、谷氨酸氨基轉移酶(GOT)、乳酸脫氫酶(LDH)。

1.4 心肌組織CT-1 mRNA和gp130 mRNA表達的檢測

1.4.1 總RNA提取 常規Trizol提取，總RNA溶解在10μl無RNA酶的水中，70℃水浴10 min，冰浴5 min，紫外分光比色測樣品RNA的量。

1.4.2 逆轉錄 反應體系構成:10倍緩沖液2μl、10 mmol/L dNTP 2 μl、Rnasin 0.5 μl、AMV 0.7 μl、Oligo(dT)15引物 1 μl、模板2μg，加無 RNA酶水補足至20μl。混勻后42℃水浴40 min;95℃水浴5 min。

1.4.3 PCR擴增 將 CT-1 mRNA、gp130 mRNA和內對照β-actin mRNA分別進行擴增轉錄相應的cDNA。CT-1 mRNA和gp130 mRNA反應體系構成:Taq 0.1 ml、10倍緩沖液2μl、2.5 mmol/L dNTP 2 μl、CT-1 引物或 gp130 引物 1 m l、模板1 ml、余量以蒸餾水補足體積至20 m l;反應參數為94℃ 5 min，94℃變性 30 s，52℃ 退火 45s，72℃ 延伸 45 s，35 循環，72℃10 min。β-actinmRNA反應體系除引物不同以外，其余同CT-1 mRNA反應體系;反應參數為94℃ 5 min，94℃變性30 s，54℃退火45 s，72℃延伸45 s，28 循環，72℃ 10 min。取8 μl產物在含溴乙錠的1.2%瓊脂糖凝膠上進行電泳，采用圖像掃描系統對各組PCR產物進行光密度掃描。

1.5 主要試劑 卡托普利粉劑由常州制藥廠提供;Iso由美國Sigma公司提供;Trizol由Invitrogens公司提供;RT-PCR反應試劑盒由Promega公司提供;引物由上海申能博彩生物科技有限公司提供，CT-1引物:上游為5'-GCGTCTTCTCAGCTAAGG-3'，下游為 5'-GAACACACATGGATGACATAG-3'，擴增片段范圍200 bp;gp130引物:上游5'-CATCAACAGAACGGCATCCAG-3'，下游 5'-TCACTTTATCCACGGGGTCAA-3'，擴增片段范圍416 bp;β-actin引物:上游為 5'-GCCCCTGAGGAGCACCCTGT-3'，下游為 5'-ACGCTCGGTCAGGATCTTCA-3'，擴增片段范圍300 bp;Taq由寶生物工程(大連)有限公司提供;100 bp DNA Ladder由北京天為時代科技有限公司提供。

1.6 統計學處理 用SPSS12.0進行統計分析。數據以±s表示，多個樣本之間用方差分析，兩組之間比較用q檢驗。

2 結果

2.1 光學顯微鏡下觀察心肌組織的病理變化 對照組大鼠心肌組織未見異常。Iso損傷組心肌組織呈不同程度壞死，為多發性灶狀和片狀壞死，壞死中心部心肌細胞崩解消失，并有大量炎性細胞浸潤，壞死部位常累及左室游離壁和室間隔近心尖部以及乳頭肌和心內膜下層心肌;Cap預處理組心肌細胞呈不同程度的空泡變性及顆粒變性，間質水腫明顯，嚴重者可見小灶狀壞死，心肌壞死灶內可見淋巴細胞浸潤，病灶多分布于心內膜下。Cap預處理組與Iso損傷組比較，心肌壞死面積占心肌總面積的百分比明顯減少，差異有統計學意義(P＜0.01)。見圖1，表1。

2.2 大鼠血清心肌酶測定 與對照組比較，Iso損傷組血清CK、GOT、LDH均升高(P＜0.01);與 Iso損傷組比較，Cap預處理組 CK、GOT、LDH明顯降低(P ＜0.01，P ＜0.05)。

2.3 心肌CT-1 mRNA和gp130 mRNA表達 三組大鼠心肌組織均能擴增出200 bp和416 bp的DNA條帶。與對照組比較，Iso損傷組CT-1 mRNA、gp130 mRNA表達增高(P＜0.01);與Iso損傷組比較，Cap預處理組CT-1 mRNA、gp130 mRNA表達明顯增高(P＜0.01，P＜0.05)。見圖2，表1。

表1 大鼠心肌壞死面積、血清心肌酶及心肌CT-1 mRNA、gp130 mRNA表達(±s，n=20)

表1 大鼠心肌壞死面積、血清心肌酶及心肌CT-1 mRNA、gp130 mRNA表達(±s，n=20)

與Iso損傷組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.05;與對照組比較:3)P＜0.01

871±128 92±13 433±42 0.34±0.05 0.64±0.07 Iso損傷組 12.37±1.903) 3187±2563) 175±253) 632±953) 0.56±0.093) 0.75±0.093)Cap預處理組 5.45±0.901) 1628±1981) 133±231) 583±602) 0.71±0.181) 0.83±0.082)CT-1 mRNA gp130 mRNA對照組組別 心肌壞死面積(%) CK(U/L) GOT(U/L) LDH(U/L)0

圖1 各組大鼠心肌組織(HE，×66)

圖2 各組大鼠心肌組織CT-1 m RNA、gp130 m RNA、β-actin RT-PCR擴增產物

3 討論

在心肌細胞，CT-1與其受體gp130結合后，誘導gp130二聚體形成，從而激活胞漿內的酪氨酸激酶，轉導胞內信號。CT-1通過兩條不同的信號轉導途徑發揮不同的作用〔3〕，一條是通過Janus酪氨酸激酶/信號傳導子和轉錄激活子(JAK/STAT3)途徑介導心肌肥大;另一條是通過P42/P44絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)途徑介導心肌細胞保護作用。

本實驗說明在使用異丙基腎上腺素致大鼠心肌損傷后，CT-1和gp130在轉錄水平呈反應性升高。MAPK途徑是細胞外信號引起核反應的細胞信息傳遞的共同通路，CT-1作為一種細胞因子可通過G蛋白或酪氨酸蛋白激酶的活化，激活Raf→MAPK激酶→MAPK磷酸化的連鎖反應，經過MAPK的核轉位，引起轉錄因子的磷酸化，調節應激性蛋白基因的表達，誘導熱休克蛋白 70(hsp70)和熱休克蛋白 90(hsp90)的合成〔4，5〕。hsp70是細胞保護性蛋白，能促進新生多肽鏈的正確折疊，協助新生蛋白質的合成和修復損傷的蛋白質，維持蛋白質合理構象;并能激活某些酶的作用，以維護細胞的功能和生存。推測CT-1在異丙基腎上腺素致大鼠心肌損傷過程中升高，可能是對缺血性心肌損傷的適應性反應。

組織、器官經過短時間，多次重復缺血，不僅不會發生累積性損傷，相反能減輕隨后的長時間缺血引起的損傷，這種現象稱之為缺血預適應(IP)。根據IP的機制，可以有目的地模擬或影響IP的各環節，以藥物代替短暫缺血，能更有效地保護心臟，稱之為藥理性預適應。Cap是第一代ACEI，在臨床上廣泛使用，并被成功應用于IP動物模型的制備。在IP的保護作用研究中發現有hsp70的表達增加，且與IP的保護作用呈正相關，但hsp70表達上調的具體機制尚不明確〔6〕。本文說明卡托普利預處理能減輕心肌損傷，并能促進心肌損傷后CT-1及其受體gp130在轉錄水平的表達。推測在異丙基腎上腺素致大鼠心肌損傷過程中，Cap預處理可能是通過促進CT-1的表達，激活MAPK通路，誘導hsp70合成增加。hsp70能夠穩定、消除和修復細胞內變性的蛋白質，恢復細胞功能，發揮心肌保護作用。

Hattori等報道〔7〕，JAK/STAT信號通路也參與缺血預適應誘發的早期心肌保護作用，缺血預適應減輕了缺血再灌注引起的心功能障礙，改善了心肌收縮力，減少了心肌梗死面積和心肌細胞凋亡，這一系列的保護作用可被JAK抑制劑AG490消除，說明缺血預適應激活JAK/STAT3通路誘發心肌存活通路，發揮早期心肌保護作用。本實驗推測，Cap還可能是通過增加CT-1的表達，激活JAK/STAT3通路，來發揮心肌保護作用。

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5 Pelech SL，Charest DL，Mordret GP，et al.Networking with mitogen-activated protein kinases〔J〕.Mol Cell Biochem，1993;127-8:157-69.

6 黃凌瑾，劉世坤，陳勝喜，等.卡托普利在開心手術中對心臟缺血延遲期的保護作用〔J〕.湖南醫科大學學報，2001;26(1):73-6.

7 Hattori R，Maulik N，Otani H，et al.Role of STAT3 in ischemic preconditioning〔J〕.JMol Cell Cardiol，2001;33(11):1929-36.

R34

A

1005-9202(2012)12-2554-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.12.050

1 哈爾濱醫科大學克山病研究所

顧 明(1971-)，男，博士，副主任醫師，主要從事缺血性心肌病的分子生物學研究。

〔2009-05-25收稿 2009-12-21修回〕

(編輯 袁左鳴)