紅景天對大鼠肝纖維化肝臟組織中TIMP-1、Smad4表達的影響

劉東璞 盧鳳美 王明富 孟慶媛 郭夢凡 姚海濤 王 抒

(佳木斯大學司法鑒定中心，黑龍江 佳木斯 154007)

紅景天對大鼠肝纖維化肝臟組織中TIMP-1、Smad4表達的影響

劉東璞 盧鳳美 王明富 孟慶媛 郭夢凡 姚海濤 王 抒

(佳木斯大學司法鑒定中心，黑龍江 佳木斯 154007)

目的探討紅景天對四氯化碳(CCl4)誘導的大鼠肝纖維化肝組織基質金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP-1)、Smad4基因表達的影響。方法健康雄性SD大鼠60只隨機分為①正常對照組、②肝纖維化模型組、③紅景天干預組，每組20只。以CCl4腹腔注射法誘導大鼠肝纖維化，紅景天干預組大鼠在造模的同時給予紅景天灌胃，正常對照組給予橄欖油和生理鹽水灌胃，8 w實驗結束時處死動物，留取的肝臟組織做HE染色，按0～4期標準判定肝纖維化程度，應用半定量RT-PCR檢測肝組織中TIMP-1 mRNA、Smad4 mRNA的表達情況，用免疫組化檢測肝組織中TIMP-1、Smad4的表達。結果模型組大鼠肝纖維化程度處于2～4期，其中大部分達3期以上，紅景天干預組大鼠肝纖維化程度明顯減輕，只有少部分達3期。紅景天干預組大鼠肝組織中TIMP-1 mRNA陽性表達水平及蛋白陽性表達均低于模型組(P＜0.05);紅景天干預性治療組肝臟Smad4 mRNA及蛋白表達陽性率明顯低于模型組(P＜0.05);肝組織TIMP-1，Smad4蛋白表達與TIMP-1，Smad4 mRNA水平變化呈正相關。結論中藥紅景天能有效抑制CCl4誘導的肝纖維化大鼠肝臟中TIMP-1、Smad4表達。

紅景天;肝纖維化;TIMP-1;Smad4

肝纖維化是多種慢性肝臟疾病發展為肝硬化的重要環節，有效控制肝纖維化進展具有極為重要的臨床意義。紅景天具有保護肝細胞、調節機體免疫功能等多種功效，在動物實驗證實其具有良好的干預四氯化碳(CCl4)誘導的肝纖維化作用。基質金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMPs)是肝纖維化過程中的關鍵因子，具有抑制基質金屬蛋白酶(MMPs)活性的功能，可與MMPs非共價結合而抑制其活性，也可與酶原結合阻止其活化，其在肝組織中的表達水平可以反映肝組織纖維化程度〔1，2〕。Smads是一族傳遞TGFβ信號的分子，其中Smad4為傳遞信息必須的共用Smad分子，干擾或阻斷該信號轉導通路，有可能阻止肝纖維化進程〔3〕。本文檢測CCl4誘導肝纖維化大鼠肝組織中TIMP-1、Smad4基因的表達，觀察紅景天對CCl4中毒性大鼠肝纖維化模型膠原代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠60只，體重180～220 g，由佳木斯大學實驗動物中心提供。CCl4購自天津石英釧廠霸州市化工廠分廠。復方紅景天膠囊購自福州恒豐量子生物科技有限公司。組織RNA提取試劑盒及逆轉錄試劑盒為立陶宛MBI公司產品。TIMP-1、Smad4上下游引物及兔抗大鼠 TIMP-1、Smad 4的一抗由上海生物工程公司生產。辣根過氧化物酶(HRP)標記的免疫組化通用型羊抗兔的二抗工作液由北京中山生物技術有限公司生產。

1.2 方法

1.2.1 分組 隨機分組:①正常對照組;②肝纖維化模型組;③紅景天干預組，每組20只，各組間暴露因素無差別(P＞0.05)。用CCl4腹腔注射法誘導大鼠肝纖維化模型，即用100 ml/L CCl4(橄欖油稀釋)1 m l/kg，1次/w，共8 w。紅景天干預組在造模的同時給予紅景天灌胃(濃度40 g/L，劑量10 m l/kg，2次/w，共8 w)，肝纖維化模型組造模同時予生理鹽水灌胃，正常對照組予等量橄欖油和生理鹽水處理。各組大鼠在最后一次CCl4注射后48 h處死，部分肝臟用4%甲醛固定，留做病理檢查，其余標本迅速放到－80℃冰箱保存。

1.2.2 常規病理學檢查 病理學切片用HE染色，按2000年西安會議由中華醫學會傳染病與寄生蟲病學分會、肝病學分會聯合修訂的慢性肝炎分級分期標準判定肝纖維化程度〔3〕。

1.2.3 RT-PCR檢測肝組織中TIMP-1、Smad4 mRNA TRIzol一步法提取組織總RNA，總RNA反轉錄成cDNA，PCR反應。取10μl PCR擴增產物加入25 g/L溴乙錠瓊脂糖凝膠中，以80 V/cm電壓電泳50 min，在紫外線下可見相應長度的目的基因和內參的擴增條帶，將電泳結果直接置于凝膠分析系統中對條帶進行分析。根據GenBank數據庫，應用Primer-3軟件設計目的基因的擴增引物:TIMP-1:上游:5'-CTTCCACAGGTCCCACAA-3'，下游:5'-CAGCCCTGGCTCCCGAGG-3'，長度 238 bp;GAPDH:上游:5'-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3'，下 游:5'-AGGGGTCTACATGGCAACTG-3'，長度500 bp。采用25 μl的反應體系。其中GAPDH與目的基因的引物濃度均為1μmol/L。TIMP-1 反應條件分別是:94℃ 2 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃50 s，28個循環(經多次預試驗摸索最佳實驗條件);72℃7 min;Smad 4:上游:5'-TGCAGGTGGCTGGTCGGAAAG-3'，下游:5'-AGGATGATTGGAAATGGGAGGCTG-3'，長度 710 bp，反應條件分別是:94℃ 2 min，94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 50 s，28 個循環;72℃ 7 min;PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后用Bio-RadGel Doc2000型凝膠成像系統照相并用QuangtityOne軟件計算基因相對表達值。

1.2.4 免疫組化檢測肝組織中TIMP-1，Smad4 用3'，3-二氨基聯苯胺(DAB)二步法檢測肝組織中TIMP-1、Smad4，方法:石蠟切片經常規脫蠟至水。用30 m l/L H2O2消除內源性過氧化氫酶。以檸檬酸鹽工作緩沖液微波熱修復。用100 m l/L正常山羊血清封閉非特異性抗原。滴加1∶200的一抗，4℃孵育過夜，滴加適量的二抗(HRP標記)工作液，37℃孵育20 min，DAB顯色，蘇木素液復染，封片。以磷酸鹽緩沖液代替第一抗體作陰性對照。對陽性染色采用HPIAS-2000型高清晰度彩色病理圖文分析系統進行灰度分析，按照Weidner方法，雙盲法閱片，先在低倍鏡下選擇陽性結果密集區域，然后在高倍視野下自動計算A值，取平均值計為該切片的A值。

2 結果

2.1 各組肝纖維化分期 用CCl4反復腹腔注射至第8周，模型組大鼠均形成肝纖維化或早期肝硬化，纖維化程度在2～4期之間，20只大鼠中有14只在3期以上，而紅景天防治組大鼠肝纖維化程度較模型組減輕。

2.2 大鼠肝組織TIMP-1表達 模型組大鼠肝組織TIMP-1 mRNA的水平較正常組顯著增高(P＜0.05);紅景天干預組大鼠肝組織中TIMP-1 mRNA的水平較模型組顯著降低(P＜0.05)。在正常組織切片中可見肝組織中TIMP-1呈微弱水平表達，陽性信號主要見于肌成纖維細胞、成纖維細胞、血管內皮細胞中。模型組中TIMP-1的表達較正常對照組顯著增強，陽性表達以匯管區及纖維間隔中最明顯，主要表現為胞質著色，同時在纖維間隔內也可見，其A值與正常對照組相比差異有統計學意義(P＜0.05)。紅景天干預組大鼠肝組織中TIMP-1的陽性率低于模型組，其A值相比差異有統計學意義(P＜0.05)。見表 1，圖 1，圖 2。

2.3 大鼠肝組織Smad4表達 RT-PCR檢測正常肝組織未見明顯Smad4 mRNA陽性表達細胞，模型組大鼠肝組織Smad4 mRNA的水平較正常組顯著增高(P＜0.01);紅景天干預組大鼠肝組織中Smad4 mRNA的水平較模型組顯著降低(P＜0.05)。免疫組化染色可見正常大鼠肝組織未檢出明顯的Smad4表達，模型組大鼠肝組織Smad4表達明顯增加，棕黃色陽性顆粒定位于細胞質和細胞核，陽性細胞集中于匯管區，以梭狀的間質細胞為主，肝細胞未見明確陽性反應。紅景天干預組大鼠肝組織Smad4表達較模型組明顯減少，陽性細胞亦主要位于匯管區，以間質細胞為主。各組陰性對照未見陽性表達，證實免疫組化和RT-PCR檢測結果具有特異性。見表2，圖3，圖4。

表1 肝組織TIMP-1表達的變化(±s，n=20)

表1 肝組織TIMP-1表達的變化(±s，n=20)

與模型組比較:1)P＜0.05

組別TIMP-1 TIMP-1 mRNA正常組 0.121±0.0671) 0.615±0.0671)模型組 0.356±0.052 0.858±0.052干預組 0.213±0.0301) 0.695±0.0301)

圖1 肝組織中TIMP-1 mRNA表達的變化

表2 肝組織Smad 4表達的變化(±s，n=20)

表2 肝組織Smad 4表達的變化(±s，n=20)

與模型組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

組別Smad4 Smad4 mRNA正常組 02) 02)模型組 0.117±0.080 0.632±0.091干預組 0.053±0.0102) 0.253±0.0181)

圖2 肝組織中TIMP-1表達(×100)

圖3 肝組織中Smad4 mRNA表達的變化

圖4 肝組織中Smad4表達(×100)

3 討論

近年來，分子病理學、分子生物學、分子藥理學等學科的快速發展使人們對肝纖維化發生機制的認識不斷深化，肝星狀細胞(HSC)是肝組織內生成膠原纖維等細胞外基質的主要細胞來源，HSC的激活是造成肝纖維化的中心環節〔4〕。TIMP-1雖然不是肝纖維化的始發因素，但在肝纖維化的發展過程中起重要的促進作用，在肝臟受損后，通過一系列細胞因子的作用激活HSC。TIMP-1大量表達可以在酶原活化階段與MMPs形成穩定復合體，阻礙MMPs酶原自我激活，也可在活化的酶原階段與活化的 MMPs形成 1∶1復合體，抑制其活性〔5，6〕。

TGFβ-Smad信號通路是肝纖維化時主要的信號轉導通路〔7～9〕，Smads是一族傳遞 TGFβ 信號的分子，其中與受體結合的是Smad2、3，具有抑制作用的是Smad6、7，Smad4則為傳遞信息必須的共用Smad分子，阻斷或干擾該信號轉導通路有可能阻止肝纖維化進程〔3〕。

通過多年的基礎與臨床研究證實中藥紅景天具有抗慢性肝炎肝纖維化作用，其作用機制包括抑制HSC的增殖與活化，抑制膠原纖維的表達，減輕肝臟炎癥。本文結果顯示紅景天可以較好防治 CCl4損傷性肝纖維化，使大鼠肝組織 TIMP-1、Smad4的表達減少，明顯低于模型組，高于正常對照組。這就表明紅景天具有通過抑制TIMP-1、Smad4的表達，保護纖維化肝組織內包括HSC在內的細胞周圍正常的基底膜樣細胞間質，對于抑制HSC的活化與肝纖維化的發展具有重要意義，同時減弱Smad4基因的表達，從而有效地干預了TGFβ介導的肝纖維化信號傳導過程，可能是其抗肝纖維化分子機制之一。

1 劉東璞，盧鳳美.復方紅景天對大鼠肝纖維化肝臟中TIMP-1表達的影響〔J〕.世界華人消化雜志，2008;16(31):3543-6.

2 謝玉梅，周永興，聶青和.肝硬化病人血清、肝組織中金屬蛋白酶組織抑制因子的表達及意義〔J〕.中華醫學雜志，2001;81(6):805-7.

3 KondouH，Mushiake S，EtaniY，etal.A blocking peptide for trans-forming growth factor-beta 1 activation preventshepatic fibrosisin vivo〔J〕.J Hepatol，2003;39(5):742-8.

4 Benyon RC，Arthur MJ.Extracellular matrixdegradation and the role of hepatic stellate cells〔J〕.Semin Liver Dis，2001;21(2):373-84.

5 Visse R，Nagase H.Matrixmetalloproteinases and tissue inhibitorsofmetalloproteinases:structure，function，and biochemistry〔J〕.Circ Res，2003;92(6):827-39.

6 Knittel T，Mehde M，Grundmann A，et al.Expression ofmatrix metalloproteinases and their inhibitors during hepatic tissue repair in the rat〔J〕.Histochem Cell Biol，2000;113(3):443-53.

7 吳曉玲，曾維政.紅景天甙對肝纖維化大鼠Samds基因表達的影響〔J〕.第四軍醫大學學報，2005;26(10):923-6.

8 Liu CH，Marianna DA，Gaca E，etal.Smads2 and 3 are differentially activated by transforming growth factor-β(TGF-β)in quiescentand activated hepatic stellate cells〔J〕.JBiol Chem，2003;278(13):11721-8.

9 徐新保，何振平，梁志清，等.阻斷轉化生長因子-β1信號傳導治療大鼠實驗性肝纖維化〔J〕.中華肝臟病雜志，2004;12(5):263-6.

R57

A

1005-9202(2012)12-2556-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.12.051

黑龍江省衛生廳科研資助項目(No.2009-355)

盧鳳美(1970-)，女，碩士，副教授，主要從事肝臟疾病的防治與預防的研究。

劉東璞(1969-)，男，碩士生導師，副教授，主要從事肝纖維化研究。

〔2011-09-26收稿 2011-12-25修回〕

(編輯 張永貴/胡國義)