熟地中水溶性多糖超聲提取工藝的正交優化

林春燕，暴 瓏，黃家園，李 淳，姜漢石，李文德，吳天秀

(1.廣東醫學院生理科學教研室，廣東湛江524023;2.廣東醫學院第一臨床學院，廣東湛江524023;3.廣東天然藥物研究與開發重點實驗室，廣東湛江524023;4.廣東醫學院解剖教研室，廣東湛江524023)

熟地為玄參科植物地黃(Rehmannia glutinosa Libosch.)的炮制加工品，有補腎陽，生精血之功效。藥理實驗表明，熟地多糖具有免疫和抑制腫瘤活性，并對心血管系統有強心、降壓、保護心肌、抑制血栓形成和降血脂等作用［1，2］，根據其水中的溶解度可分為水溶性和水不溶性兩類。目前有關熟地黃水溶性多糖提取的報道多是采用粗放的直接加熱法，關于超聲波提取熟地黃多糖工藝優化的報道卻很少見。超聲波是頻率高于20 kHz，并且不引起聽覺的彈性波。很多研究表明，利用超聲波產生的強烈振動、高的加速度、強烈的空化效應、攪拌作用等，可加速植物材料中的有效成分進入溶劑，從而增加有效成分的提取率，縮短提取時間，并且還可避免高溫對提取成分的影響［3］。本實驗擬采用超聲波強化提取熟地黃中的水溶性多糖，利用正交實驗法研究不同提取因素對熟地黃水溶性多糖提取效果的影響，并對提取工藝條件進行優化。

1 材料與儀器

1.1 材料 熟地原料為市售熟地黃飲片，干燥，粉碎過40目篩，備用。

1.2 儀器與試劑 UV－752分光光度計(上海分析儀器廠)，電熱鼓風干燥箱(上海躍進醫療有限公司工廠)，RE－

2 方法

2.1 水溶性多糖的提取與精制 稱取熟地干粉10 g，按一定料液比加水浸泡30 min，按一定的提取時間、提取溫度和提取次數進行超聲提取，提取液冷卻后抽濾，再用漏斗過濾，合并提取液，用旋轉蒸發器減壓濃縮至約50 mL，加入無水乙醇，靜置過夜，抽濾，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，得精制多糖，真空干燥后稱重，計算多糖得率。

2.2 多糖含量測定

2.2.1 葡萄糖標準溶液的配制 精密稱取干燥至恒重的葡萄糖標準品10.1 mg，溶解并定容至100 mL容量瓶，即得葡萄糖標準儲備液，其濃度為0.101 mg·mL－1。

2.2.2 6%苯酚溶液的配制 取苯酚100 g，加鋁片0.1 g和碳酸氫鈉0.05 g，蒸餾。收集182℃餾分，稱取12 g加蒸餾水190 g溶解，即得6%的苯酚溶液，置于棕色瓶中備用。

2.2.3 標準曲線的制備 用移液管分別吸取葡萄糖貯備液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、0.9、1.0 mL分別置于20 mL的比色管中，加蒸餾水至1 mL，另取1.0 mL蒸餾水做空白對照。分別加入6%的苯酚溶液0.5 mL，搖勻，迅速滴加2.5 mL濃硫酸充分搖勻，室溫放置30 min，于紫外分光光度計490 nm波長處測定吸光度值，同樣條件下以蒸餾水為空白對照。以濃度(C)對吸光度(A)，進行線性回歸，求得回歸方程A= 0.008 7C+0.005 6，r=0.999 7。

2.2.4 樣品含量測定 精確吸取樣品液(精密稱取60℃干燥至恒重的熟地黃多糖0.100 g，置100 mL容量瓶中，加入少量蒸餾水溶解，并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL)，按標準曲線制備項下方法測定其吸收度值，按下式計算多糖含量，多糖含量(%)=CDf/W×100(C為樣品溶液的葡萄糖的質量，D為樣品溶液的稀釋倍數，f為換算因素)。

2.3 水溶性多糖提取工藝優化

2.3.1 單因素實驗 準確稱取10 g熟地樣品，以水為提取溶劑，改變提取時間、提取溫度、料液比和提取次數等因素，以多糖得率為考察指標，進行單因素實驗。

2.3.2 正交實驗 根據單因素實驗結果，選取料液比、提取時間、提取溫度和提取次數為主要考察因素，以多糖得率及多糖含量作為考察指標，試驗采用綜合加權評分法［4］，權重系數均為0.5。分別把試驗項中最大的指標定為100分，其他各號按下式評分:綜合評分=(各實驗組多糖得率/多糖得率最大值)×100×0.5+(各實驗組多糖含量/多糖含量最大值)×100×0.5。采用L9(34)正交表進行實驗。因素水平見表1。

3 結果

3.1 單因素實驗結果

3.1.1 提取時間的影響 以蒸餾水為提取溶劑，料液比為1∶20，提取溫度為60℃，提取1次，提取時間為0～90 min時，多糖的提取效率隨著時間的延長有較大的提高，超過150 min有降低的趨勢，結果見圖1。

表1 因素水平表

圖1 提取時間對提取效果的影響

3.1.2 料液比的影響 以蒸餾水為提取溶劑，提取時間為60 min，提取溫度為60℃，提取1次，隨著料液比的增大，多糖得率也逐漸增大。但料液比達到1∶20時，增加提取溶劑，無法增加多糖得率，結果見圖2。

圖2 料液比對提取效果的影響

3.1.3 提取溫度的影響 以蒸餾水為提取溶劑，料液比為1∶20，提取時間為60 min，提取1次，提取溫度為60℃時，多糖得率最高，超過60℃多糖含量逐漸下降，結果見圖3。

圖3 溫度對提取效果的影響

3.1.4 提取次數的影響 以蒸餾水為提取溶劑，料液比為1∶20，提取時間為60 min，提取溫度為60℃ 時，多糖的得率隨著提取次數的增加而增大，從節省時間提高效率等方面考慮，提取次數控制在3次以內比較合適，結果見圖4。

圖4 提取次數對提取效果的影響

3.2 多糖正交實驗結果 測定結果經極差直觀分析見表2、3可知，各因素對熟地水溶性多糖提取效果的影響程度依次為:提取時間＞提取次數＞超聲溫度＞料液比。最佳工藝組合為超聲溫度60℃，提取3次，超聲時間60 min，料液比1∶30。按優選的最佳超聲提取工藝A2B2C3D1進行驗證實驗，測定多糖含量(重復3次)，其含量分別為12.85%，12.77%，12.46%。平均含量為12.69%，RSD=1.62%。

表2 水溶性多糖正交實驗表

表3 水溶性多糖提取綜合評分方差分析結果

4 討論

本實驗以水溶性多糖的得率作為單因素提取工藝的考察指標，能較簡便、快捷的確定采用正交實驗優選超聲波法的基本工藝條件及因素，再以多糖得率及多糖的含量兩者作為綜合評定正交實驗優選超聲提取工藝的指標，結果表明，不同超聲溫度、超聲時間、提取次數和料液比都對多糖的提取率有不同程度的影響，其中超聲提取時間及次數兩種因素對實驗結果影響最大。綜合實驗結果和提取過程中經濟成本等因素，本實驗確定了超聲波提取熟地水溶性多糖的最佳工藝為:超聲溫度60℃，超聲時間60 min，提取次數為3次，料液比1∶30。

［1］ 劉培建，苗明三，高漸聯.熟地黃多糖對氣血雙虛小鼠全血細胞及血清粒－巨噬細胞集落刺激因子水平的影響［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2008，12(38): 7543－7546.

［2］ 李發勝，徐恒瑰，李明陽，等.熟地多糖提取物對小鼠免疫活性影響［J］.中國公共衛生，2008，24(9):1109－1110.

［3］ 曾里，夏之寧.超聲波和微波對中藥提取的促進和影響［J］.化學研究與應用，2002，14(3):245－249.

［4］ 宋崎，周小初，宋英，等.益母草炮制工藝的優化［J］.時珍國醫國藥，2009，20(3):709－710.