山東漢族骨髓供者HLA-A*02組基因多態(tài)性DNA測(cè)序分型研究

董 魁，賈 挺，劉 麗，姜其聲，金孟民，林海濤，吳曉玲，莊云龍

(山東省血液中心，濟(jì)南250014)

人類(lèi)白細(xì)胞抗原(HLA)位于6號(hào)染色體短臂區(qū)域，是由一組緊密連鎖的基因座所組成的具有高度多態(tài)性的遺傳復(fù)合體。HLA 是機(jī)體內(nèi)特異性免疫識(shí)別和免疫應(yīng)答的主要成分，是影響造血干細(xì)胞移植成功的關(guān)鍵因素之一，具有顯著的人種、民族和地域差異。截至2011年4月，HLA-A位點(diǎn)的等位基因數(shù)目已達(dá)1 601個(gè)，其中HLA-A*02家族包含了405個(gè)等位基因。HLA-A*02等位基因在不同地區(qū)和種族中的分布存在較大差異，且該基因家族某些等位基因錯(cuò)配會(huì)導(dǎo)致接受造血干細(xì)胞移植的患者發(fā)生重度急性移植物抗宿主病(aGVHD)，而該基因家族的另一些錯(cuò)配對(duì)移植結(jié)果無(wú)不良影響［1，2］。HLA-A*02是山東骨髓庫(kù)中最主要的HLA-A等位基因之一，其等位基因水平多態(tài)性尚無(wú)資料積累。本研究旨在調(diào)查分析山東骨髓庫(kù)漢族人群HLA-A *02位點(diǎn)各等位基因的分布情況，初步評(píng)估山東漢族人群HLA-A*02位點(diǎn)匹配情況及移植風(fēng)險(xiǎn)，為HLA-A*02患者在山東骨髓庫(kù)尋找合適的供者提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 隨機(jī)選取750例山東漢族骨髓志愿捐獻(xiàn)者(男401例、女349例，年齡23～45歲，平均36歲)的EDTA抗凝全血。

1.2 HLA-A*02等位基因檢測(cè) 采用 EZ Bead system-32 DNA提取工作站提取DNA并測(cè)定OD260和OD280值，調(diào)整DNA濃度。以提取的DNA為模板，Taq酶(0.037 5 U)和包含引物(1 μM)等的混合物共10 μL;PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增HLA-A基因的外顯子和內(nèi)含子序列。PCR擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)為96℃、2 min，1個(gè)循環(huán);96℃、30 s，65℃、30 s，5個(gè)循環(huán);72℃、120 s，96℃、30，62℃、30 s，35個(gè)循環(huán);72℃、120 s，10℃、4 h。反應(yīng)結(jié)束后取2.5 μL于1.5%的瓊脂糖凝膠上檢驗(yàn)擴(kuò)增產(chǎn)物。在對(duì)應(yīng)陽(yáng)性孔內(nèi)的EP管中加入FastAP(1 U/μL)0.8 μL和Exonuclease I(20 U/μL)0.2 μL，混勻后于PCR儀中37℃、15 min，85℃、15 min。依照電泳圖稀釋PCR產(chǎn)物后將各位點(diǎn)PCR產(chǎn)物1 μL分別轉(zhuǎn)移到標(biāo)記好的擴(kuò)增板對(duì)應(yīng)位置，取380 μL(配100個(gè)PCR混合物)各種Sequencing Primer Mix，分別置于16個(gè)1.5 mL潔凈的離心管內(nèi)，再分別加入20 μL BigDye，混勻后，取各混合物4 μL加入到對(duì)應(yīng)擴(kuò)增板孔，共5 μL PCR反應(yīng)體系，雙向單鏈擴(kuò)增HLA-A基因的2/3/4外顯子。Sequencing PCR反應(yīng)參數(shù)為96℃、1 min，1個(gè)循環(huán);96℃、100 s，60℃、120 s，40個(gè)循環(huán);10℃、4 h。擴(kuò)增結(jié)束后，向每孔中加入125 mM EDTA 2.5 μL，混勻后，加入無(wú)水乙醇15 μL，再充分混勻，室溫避光10 min。2 250 g離心30 min。將板倒置于吸水紙上，180 g再離心1 min。70%乙醇洗滌干燥后，每孔加入甲酰胺10 μL。置于3730測(cè)序儀上檢測(cè)。測(cè)序后導(dǎo)出的結(jié)果由ATF1.0.2.41(Conexio Genomics)軟件分析，依據(jù)的HLA數(shù)據(jù)庫(kù)版本為08/ 13/10。觀察HLA-A*02的基因頻率、等位基因構(gòu)成比、血清學(xué)組特異性頻率分布，對(duì)HLA-A*02陽(yáng)性標(biāo)本行高分辨分型，直接計(jì)數(shù)法得到HLA-A*02各等位基因的觀察數(shù)，并計(jì)算各等位基因頻率。結(jié)果與不同國(guó)家和地區(qū)人群HLA-A*02各等位基因分布情況比較。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。不同人群間HLA-A*02等位基因頻率分布比較采用χ2檢驗(yàn)，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HLA-A*02的基因檢測(cè)情況 750份標(biāo)本共363份HLA-A*02陽(yáng)性，HLA-A*02的基因頻率為0.288。共檢出6種HLA-A*02等位基因，分屬3種血清學(xué)特異性，各等位基因頻率、等位基因構(gòu)成比及相應(yīng)血清學(xué)特異性基因頻率見(jiàn)表1。

表1 750份標(biāo)本HLA-A*02基因頻率、等位基因構(gòu)成比和血清學(xué)組特異性頻率分布

2.2 363份HLA-A*02陽(yáng)性標(biāo)本HLA-A*02高分辨分型 見(jiàn)表2。其中以A*0201 A*1101分型最常見(jiàn)，血清學(xué)組特異性以A2、A11觀察數(shù)目最多。

表2 750份樣品中HLA-A*02等位基因主要組合和血清學(xué)組特異性組合分布

2.3 不同國(guó)家和地區(qū)人群HLA-A*02各等位基因分布 山東漢族骨髓供者與其他人群HLA-A*02等位基因分布及其頻率比較見(jiàn)表3。山東漢族以A *0201(A2)為優(yōu)勢(shì)基因，日本和韓國(guó)人群同山東漢族一致，但與韓國(guó)人群中A*0201的分布相比差異顯著。香港、四川和臺(tái)灣人群中則以A*0207(A2)為優(yōu)勢(shì)基因，與山東漢族中的該基因分布相比有顯著性差異。

表3 不同國(guó)家和地區(qū)人群HLA-A*02各等位基因分布

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，A*0201是北方漢族人群的優(yōu)勢(shì)基因［8］，而 A*0207是南方漢族人群的優(yōu)勢(shì)基因［3～5］，本研究結(jié)果顯示，HLA-A*0201基因頻率最高(0.137)，A*0210基因頻率最低;以A*0201在HLA-A*02中的構(gòu)成比最高(47.56%)，即山東骨髓庫(kù)中A*0201是最主要的HLA-A*02等位基因，此符合北方漢族的特征。除優(yōu)勢(shì)基因不同外，山東漢族A*0206基因構(gòu)成比高于香港、四川和臺(tái)灣人群，而A*0207基因構(gòu)成比卻低于香港、四川和臺(tái)灣人群。山東漢族A*0203的構(gòu)成比低于香港、四川和臺(tái)灣人群，這也符合A*0203是南方漢族人群中的一個(gè)常見(jiàn)基因的特征。以上結(jié)果表明山東漢族HLA-A*02等位基因的總體分布格局與香港、四川和臺(tái)灣人群存在明顯差異。值得注意的是，中國(guó)人群A*0203基因的構(gòu)成比均明顯高于日本和韓國(guó)人群，表明日本和韓國(guó)人群中HLA-A*02等位基因分布與中國(guó)人群之間存在較大差異。A*0205屬于另外一個(gè)HLA-A*02亞群，與其余5個(gè)等位基因相比，在基因序列和進(jìn)化關(guān)系上存在較大差異，這一亞群在亞裔人群中很罕見(jiàn)［9］。

研究HLA-A*02位點(diǎn)的匹配情況對(duì)探討移植的風(fēng)險(xiǎn)具有深遠(yuǎn)的臨床意義。Kawase等［1］發(fā)現(xiàn)，HLA-A*0201者接受A*0206的移植物以及A* 0207者接受 A*0206的移植物，其病死率和aGVHD的發(fā)病率均會(huì)顯著增加。Morishima等［2］也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的移植案例，同HLA-A等位基因匹配的移植相比，A*0201/A*0206錯(cuò)配的移植受者病死率顯著增高，且aGVHD發(fā)病率有增加的趨勢(shì)。這些報(bào)道表明，含有A*0206的錯(cuò)配會(huì)增大造血干細(xì)胞移植失敗的風(fēng)險(xiǎn)，A*0206不適合作為A*0201和A*0207的供者。山東漢族人群A*0206的基因頻率相對(duì)較高，A*0206和A*0201等位基因相對(duì)頻率之和超過(guò)70% ，與香港、四川及臺(tái)灣人群相比，山東骨髓庫(kù)漢族捐獻(xiàn)者由A*0201與A*0206錯(cuò)配引起的移植風(fēng)險(xiǎn)較高。值得注意的是，上述報(bào)道中其他A*02的等位基因錯(cuò)配的供患者人數(shù)均較少，此可能會(huì)掩蓋一些涉及其他等位基因的禁忌錯(cuò)配，還有待于進(jìn)一步研究。我們認(rèn)為，在衡量HLA等位基因群體分布對(duì)造血干細(xì)胞移植的影響時(shí)，除多態(tài)性水平比較外，分析主要的錯(cuò)配類(lèi)型對(duì)移植效果的影響亦是非常必要的。

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