動脈粥樣硬化患者基質金屬蛋白酶-9及其抑制物-1基因表達與痰濁證素的相關性研究*

談曉東 蘇 偉 高 楓 周春剛 陸 曙

（南京中醫藥大學無錫附屬醫院 無錫市中醫醫院，江蘇 無錫 214001）

動脈粥樣硬化（AS）是具有慢性炎癥反應特征的病理過程，其發展始終伴隨炎癥反應。AS的形成是動脈對內膜損傷做出的炎癥-纖維增生性反應的結果。有研究認為循環血液中基質金屬蛋白酶－9（MMP-9）與基質金屬蛋白酶抑制物－1（TIMP-1）水平可作為反映AS嚴重程度的良好指標［1］。筆者就AS痰濁證素與MMP-9及TIMP-1的關系進行了研究，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2009年6月至2010年2月南京中醫藥大學無錫附屬醫院（無錫市中醫醫院）心血管科AS住院患者78例，男性32例，女性46例；年齡（69.91±10.94）歲，痰濁證素30例，非痰濁證素48例。另從本院體檢中心匹配年齡與性別，選取60例健康人作為健康對照組。中醫證素的辨證結合2002年衛生部《中藥新藥治療高血壓病的臨床研究指導原則》［2］和《中藥新藥治療胸痹（冠心病心絞痛）臨床研究指導原則》［2］、《中醫診斷學》［3］相關內容，確定 AS 患者的中醫“證素”診斷標準。由同一位具有多年臨床經驗的主任中醫師對該部分患者運用中醫望、聞、問、切四診，進行中醫證素評估，準確、全面收集證素。

1.2 MMP-9及TIMP-1基因表達的測定方法 （1）全血總RNA抽提。取入組者晨空腹血2 mL，經EDTA-2Na抗凝，0.3 mL全血采用3S柱離心式血液總RNA抽提試劑盒（K3620上海博彩生物科技有限公司）抽提RNA，RNA提取物-80℃保存。（2）MMP-9及TIMP-1 mRNA表達水平測定。通過實時熒光定量PCR技術進行相對定量檢測。全血總RNA合成cDNA使用TAKARA反轉錄反應試劑盒（DRR037S大連寶生物工程有限公司）。實時熒光定量PCR反應體系為20μL，包括2×SYBRRPremix Ex Taq TM，1~100 ng cDNA，50 pmol/μL引物。兩步法PCR循環條件：預變性95℃ 30 s 1個循環，變性95℃ 5 s，退火/延伸 60℃ 20 s共 40個循環。 溶解曲線分析95℃ 1 s，65℃ 15 s，95℃ 1 s。

1.3 相對定量分析 相對定量分析采用Light Cycler Relative Quantification（Version1.5）軟件，標準化比值計算公式采用2-△△CT法，△CT （患者樣本）=CT目的基因-CT內參基因，△CT（校正品）=CT目的基因-CT內參基因，△△CT=△CT（患者樣本）-△CT（校正品）。

1.4 統計學處理 所有數據采SPSS17.0軟件包進行統計分析。計量資料以）標準差表示；經正態性檢驗主要觀察指標均符合正態分布。計量指標兩組間、組內比較采用student-t雙尾檢驗；多組計量指標均數間比較，方差齊時采用單因素方差分析，方差不齊時，采用多個獨立樣本非參數K－S秩和檢驗。P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 MMP-9及TIMP-1基因片段電泳結果 PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示：對照組與實驗組的內參基因GAPDH的片段大小為94 bp左右，TIMP-1基因片段的大小為102 bp左右，MMP-9基因片段的大小為108 bp左右。如圖1。

圖1 MMP-9、TIMP-1及GAPDH基因片段電泳圖

2.2 MMP-9、TIMP-1和GAPDH基因擴增產物溶解曲線 （Tm） 分析溶解曲線顯示MMP-9、TIMP-1和GAPDH的PCR產物均具有一明顯而尖峭的峰，其溶解溫度 MMP-9為 86.40℃，TIMP-1為 87.10℃，GAPDH為87.80℃。峰溶解溫度為77℃的曲線為未加模板的陰性對照樣本，具有一個弱而寬的峰，說明此峰為引物二聚體。峰圖說明MMP-9、TIMP-1和GAPDH特異性PCR產物形成固定溶解溫度的曲線峰，當反應中含有諸如引物二聚體之類的非特異性副產物時，溶解曲線可能出現兩個峰。見圖2。

2.3 MMP-9及TIMP-1基因片段的測序結果 RT-PCR產物經TA克隆，送南京金斯瑞生物科技公司測序，經比對，該兩種基因與GENBANK上人MMP-9 mRNA（GenBank：NM_004994.2）與 TIMP-1 mRNA（Gen Bank：NM_003254.2）基因片段完全一致。結果見圖3、4。

圖2 MMP-9、TIMP-1和GAPDH基因擴增產物溶解曲線（Tm）圖

圖3 MMP-9基因片段序列圖

圖4 TIMP-1基因片段序列圖

2.4 痰濁證素與非痰濁證素組MMP-9、TIMP-1基因表達水平指標比較 痰濁證素組MMP-9基因表達水平大于非痰濁證素組，且差異有統計學意義（t=2.418，P＜0.05）；痰濁證素組TIMP-1基因表達水平大于非痰濁證素組，且差異有統計學意義（t=2.180，P＜0.05）。 見表 1。

表1 兩組MMP-9、TIMP-1基因表達水平比較

表1 兩組MMP-9、TIMP-1基因表達水平比較

與痰濁證素組比較，△P＜0.05。

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3 討 論

運用證素進行組合辨證，都有助于摒棄紛繁復雜的表象的干擾，直接把握疾病本質，提高中醫辨證論治的可操作性、準確性，對臨床診治具有很大指導意義。目前發現，AS的發生、發展與MMP-9及TIMP-1基因表達水平有著重要的關系［4］。因此，監測血清MMP-9、TIMP-1的基因表達水平可用于預測AS發生、發展，有利于及早采取臨床干預降低死亡率及改善預后。

目前認為，患者先天稟賦不足，陽無以化氣，陰無以成形，導致膏脂過多，滲入血中，發生高脂血癥而致AS。AS患者多為老年患者，腎虛不能化氣行水，水泛而為痰；肺氣不足，肺失宣降，津液不得通調輸布，津液留聚而生痰。無錫地處長江以南，依山傍水，氣候宜人，居民喜食甜膩之品，易礙脾傷胃，故AS的證素分布多以痰濁偏多。

現代研究認為，“痰濁”與高脂血癥和高凝狀態相關［5］，而脂質代謝紊亂是AS形成的重要因素，AS患者中合并脂質代謝異常的比例較高。一般認為，痰濁是高脂血癥的基本病機，而血漿化學成分改變可引起血漿黏度增高，并能直接影響AS的發生。血脂代謝紊亂等病理因素導致的血管硬化、管腔狹窄，加上血液的流變性異常，血流緩慢，造成組織器官供血不足而缺血缺氧，代謝產物堆積，有可能是痰濁作為中醫病理產物在腦動脈硬化過程中發生作用的病理機制之一［6］。脂代謝異常等可以造成血管內皮細胞的功能與結構損傷，血管壁發生慢性炎癥，受到致病原侵襲的血管內皮細胞表達黏附分子，吸引大量炎癥細胞移行進入內皮層下，單核細胞轉化為巨噬細胞，后吞噬氧化低密度脂蛋白形成泡沫細胞，啟動了AS過程。泡沫細胞不斷分泌釋放包括MMPs在內的各種細胞因子，促進AS的發生發展。

本研究顯示，AS痰濁證素組的MMP-9基因表達水平明顯大于非痰濁證素組，提示AS不同證素有著共同的病理變化，加強對MMP-9的臨床研究在心血管疾病的防治中有其特殊意義，可將MMP-9基因水平檢測作為AS病情發展的一種監測指標和AS中醫辨證分型的客觀指標。而痰濁證素組的TIMP-1基因表達水平明顯大于非痰濁證素組，這個結論同樣也可以支持這一觀點。TIMP-1基因表達水平可反映AS的嚴重程度，其值隨證素的演變而變化。因此，TIMP-1基因表達水平可作為中醫痰濁證素的客觀指標。

［1］ Pradhan AD，Ridker PM.Do atherosclerosis and type 2 diabetes shares a common inflammatory basis［J］.Eur Heart J，2002，23（6）：831.

［2］ 中華人民共和國衛生部.中藥新藥臨床研究指導原則（第1 輯）［S］.1993.

［3］ 陳文彬.中醫診斷學［M］.5版.北京：人民衛生出版社，2001：341－342.

［4］ Faia KL，Davis WP，Marone AJ，et al. Matrixmetalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in hamster aortic atherosclerosis：correlation with insituzymography［J］. Atherosclerosis，2002，160（2）：325-330.

［5］ 程小曲.痰濁型冠心病與血脂、脂蛋白、載脂蛋白的關系及痰濁形成機理的探討［J］.新中醫，1994，26（3）：7-9.

［6］ 陳文強，李宗信，黃小波，等.影響腦動脈硬化患者痰證的多因素分析［J］.中國老年學雜志，2006，26（12）：1618-1619.