阿托伐他汀對人臍靜脈內皮細胞Lox-1、TNF-α及ICAM-1表達的影響＊

姜玉姬，姜 華

（延邊大學附屬醫院腎內科，吉林延吉 133000）

動脈粥樣硬化（AS）以血管壁內脂質、炎癥細胞聚集為特征［1］。研究表明炎癥因子如腫瘤壞死因子－α（TNF-α）及細胞間黏附分子（ICAM-1）在AS的發生和發展起著重要的作用，同時脂多糖（LPS）通過激活TLR 4／NF-κB信號轉導途徑來上調血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體-1（LOX-1）的表達，從而增加氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）對內皮細胞的損傷，最終加速AS的進程［2］。因此，本實驗應用LPS刺激人臍靜脈內皮細胞，誘導TLR4／NF-κB信號轉導通路的激活，從而激活下游LOX-1、TNF-α 及 ICAM-1 等 炎 癥 因 子，并 用 阿 托 伐 他 汀（ATV）進行干預，觀察其對LOX-1、TNF-α及ICAM-1表達的影響，探討ATV的抗炎及防治AS的機制。

1 材料與方法

1.1 試劑 胎牛血清（FBS）購自杭州四季青生物研究所；第Ⅷ因子相關抗原購于北京中杉金橋生物技術有限公司產品；DMEM培養基、胰蛋白酶為美國GIBCO公司產品；RNAOUT總RNA提取試劑盒、RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白定量測定試劑盒和LOX-1、ICAM-1及 TNF-α單克隆抗體和二抗為Santa Cruz公司產品。

1.2 方法

1.2.1 人臍靜脈內皮細胞的培養及鑒定 參考人臍靜脈內皮細胞的培養方法［3］，取健康嬰兒新鮮臍帶，在無菌條件下，用胰蛋白酶消化法分離人臍靜脈內皮細胞并靜止培養，用第Ⅷ因子相關抗原免疫熒光染色鑒定人臍靜脈內皮細胞。實驗時采用第2～5代細胞，待細胞生長融合成單層后用于實驗。

1.2.2 分組及干預 用含10%FBS的DMEM培養液在37℃、5%CO2培養箱中培養人臍靜脈內皮細胞18h，待細胞生長融合成單層后，隨機分為3組：即空白對照組、模型組、ATV（ATV）組，各組分別用下列方法進行干預，（1）空白對照組：僅含10%FBS的DMEM培養液；（2）模型組：含10%FBS的DMEM 培養液＋LPS（1μg／mL）；（3）ATV組：含10%FBS的DMEM培養液＋ LPS（1μg／mL）＋ATV（10μmol／L）。培養24h后收集細胞。

1.2.3 熒光定量PCR 用RNA-OUT提取總RNA，逆轉錄，應用熒光定量PCR方法測定mRNA的表達。擴增條件：94℃變性5min（94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min）×55個循環，72℃延伸5min。本實驗以GAPDH為內參照。引物由大連寶生物工程有限公司合成。LOX-1上游引物：5′-ATC CAT CAT CCC TCA AC-3′，下 游 引物：5′-GAA

AGA AGC CAG ACA AA-3′，擴增片段為142bp；TNF-α上游引物：5′-CCA TGT CTT TCT ACC CTA ATC-3′，下游引物：5′-AGC TGC TCT GTC GGA TGA GCA-3′，擴增片段為157 bp；ICAM-1上游引物：5′-GTA GCA GCA GCA GTC ATA-3′；下游引物：5′-CGG GAT AGT TTC AGG GAG-3′，擴增片段為151bp。GAPDH上游引物：5′-CTC ATG ACC ACA GTC CAT AGC-3′，下 游 引 物：5′-CAC ATT GGG GGT AGG AAC GAC-3′，擴增產物長度為211bp。用2－△△Ct法進行計算。

1.2.4 Western blot 收集人臍靜脈內皮細胞后加入預冷的細胞裂解液，收集蛋白，用BCA法檢測蛋白濃度。每條泳道以60μg蛋白上樣，經SDS-PAGE電泳，然后轉膜。加入1∶200的兔抗人LOX-1、TNF-α及ICAM-1一抗稀釋液，4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，再加入過氧化物酶標記的羊抗兔二抗稀釋液（1∶1 000），置室溫2h顯色，使用光密度分析軟件處理分析。

1.3 統計學處理 數據均應用SPSS15.0統計軟件進行分析，實驗數據以±s表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

結果見表1、2和圖1～3。

表1 ATV對人臍靜脈內皮細胞LOX-1、TNF-α及ICAM-1mRNA表達的影響（±s，n＝5）

表1 ATV對人臍靜脈內皮細胞LOX-1、TNF-α及ICAM-1mRNA表達的影響（±s，n＝5）

＊：P＜0.01，與空白對照組比較；△：P＜0.01，與模型組比較。

組別 LOX-1 TNF-α 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00模型組 2.94±0.48＊ 3.26±0.52＊ 2.91±0.54＊ATV組 1.58±0.27△ 1.78±0.43△ 1.65±0.26 ICAM-1空白對照組△

表2 ATV對人臍靜脈內皮細胞LOX-1、TNF-α及ICAM-1蛋白表達的影響（±s，n＝5）

表2 ATV對人臍靜脈內皮細胞LOX-1、TNF-α及ICAM-1蛋白表達的影響（±s，n＝5）

＊：P＜0.01，與空白對照組比較；△：P＜0.01，與模型組比較。

組別 LOX-1 TNF-α 0.259±0.014 0.471±0.026 0.253±0.027模型組 0.726±0.048＊ 0.971±0.066＊ 0.94±0.023＊ATV組 0.437±0.072△ 0.607±0.034△ 0.415±0.008 ICAM-1空白對照組△

圖1 LOX-1蛋白表達

A：為空白對照組；B：為模型組；C：為ATV組。

圖3 ICAM-1蛋白表達

3 討 論

在AS的早期，白細胞和單核細胞與血管內皮細胞的黏附、遷移是AS最重要的始動環節［4］。單核細胞與血管內皮細胞黏附、跨內皮遷移、內膜巨噬細胞聚集等多個環節均依賴于黏附分子（如ICAM-1）的作用。ICAM-1能促進免疫細胞浸潤，使單核細胞和淋巴細胞黏附于內皮，然后遷移入內皮下，單核細胞分化為巨噬細胞，形成泡沫細胞進而促進AS的發生［5］。黏附分子的表達同時受轉錄因子NF-κB的調節。研究表明脂多糖可以通過內皮細胞中的Toll樣受體4激活NF－κB，上調ICAM-1等黏附分子，參與單核細胞聚集，啟動進一步炎癥反應。TNF-α是促炎癥反應的細胞因子，能直接作用于血管內皮細胞，最終導致血管內皮細胞損傷，這可能也是TNF-α促進AS發生、發展的一個途徑。而且TNF－α還通過促進黏附分子的表達來促進白細胞、單核細胞、淋巴細胞等與血管內皮細胞的黏附及遷移，加速AS的進程［6］。ox-LDL作為致AS的獨立危險因素，經LOX-l介導使內皮細胞活化，形成正反饋促進脂質氧化，誘導核轉錄因子如NF-κB的活化，從而引發促炎因子和黏附分子（如：TNF-α、ICAM-1）的表達升高［7］；LOX-1本身也可作為內皮黏附分子，促進ox-LDL和細胞聚集于血管壁，進一步導致斑塊的炎性反應，增加斑塊的不穩定性［8］。

目前，在AS治療方面，主要以降血脂為主，同時也用一些抗氧化保護血管內皮、抗血栓形成、抗免疫損傷的藥物。他汀類藥物是調脂治療的一線藥物，通過阻斷肝臟羥甲基戊二酰輔酶A轉化為甲羥戊酸而抑制膽固醇的合成，降低血漿中的低密度脂蛋白。他汀類藥物除有效降低血脂外，還具有抗炎、抗氧化、改善血管內皮功能，調節細胞增殖等獨立于降脂之外的作用。如今他汀類藥物的非降脂效應尤其是抗炎作用越來越受到心血管及其相關領域專家的關注，其抗炎效應被認為在降低心血管事件發生率上也扮演著極為重要的角色，而且該效應可能獨立于其降脂效應［9］。

本研究結果表明，用LPS刺激24h后，LOX-1、TNF-α及ICAM-1基因和蛋白表達明顯升高，與空白對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.01），其可能機制是LPS通過TLR4／NF-κB信號轉導通路激活下游LOX-1、TNF-α及ICAM-1。用ATV干預之后，LOX-1、TNF-α及ICAM-1的基因及蛋白表達明顯下調，與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.01），說明ATV對LOX-1、TNF-α及ICAM-1有明顯的抑制作用。通過抑制LOX-1、TNF-α及ICAM-1的表達，ATV 可減少單核細胞與血管內皮細胞黏附以及內皮細胞的損傷，從而達到抗AS的作用。這可能是其抗AS的作用機制之一。

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