納豆芽孢桿菌增殖培養(yǎng)的研究

王瑩瑩王德培，2李可樂魏征劉鵬

(1.天津科技大學生物工程學院，天津300457；2.工業(yè)微生物教育部重點實驗室，天津300457)

納豆芽孢桿菌(Bacillus natto)是發(fā)酵日本傳統(tǒng)食品納豆的益生菌，屬于枯草芽孢桿菌的一個亞種。納豆芽孢桿菌能分解大分子物質(zhì)，產(chǎn)生氨基酸、有機酸、寡聚糖等易于吸收的成分，這些成分具有多種保健功能，如抗菌、溶血栓、抗腫瘤、抗氧化、降血壓、預防骨質(zhì)疏松等；另外，納豆芽孢菌能分泌各種酶和維生素，促進小腸黏膜細胞的增殖，保證腸道功能的正常[1]。因此，納豆芽孢桿菌廣泛用于各領域，對其微生態(tài)制劑的開發(fā)已成為國內(nèi)外學者的研究熱點。

本研究以實驗室保存的一株自日本市售納豆中分離的納豆芽孢桿菌為對象，優(yōu)化其液體發(fā)酵條件，為納豆芽孢桿菌的廣泛應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌種為納豆芽孢桿菌(Bacillus natto)，由天津科技大學生化工程研究室保存。

種子培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/l、牛肉膏5.0 g/l、NaCl 5.0 g/l、pH值7.2～7.4，固體培養(yǎng)基需加20 g/l的瓊脂。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖5.0 g/l、蛋白胨5.0 g/l、檸檬酸鈉1.0 g/l、MgSO4·7H2O 0.2 g/l、K2HPO44.0 g/l、KH2PO46.0 g/l，pH值7.0～7.2。

1.2 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：將納豆芽孢桿菌由肉湯斜面接種至種子培養(yǎng)基中（三角瓶，50 ml/250 ml），37℃、200 r/min培養(yǎng)11 h；

發(fā)酵培養(yǎng)：發(fā)酵培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件根據(jù)試驗進程相應改變。

1.3 測定方法[2]

1.3.1 測定吸光值

利用分光光度計，在波長為600 nm條件下測定菌液的吸光值(OD值)，測定時菌液用無菌生理鹽水稀釋10倍。

1.3.2 生長曲線測定

取培養(yǎng)好的納豆芽孢桿菌斜面，接種于含50 ml肉湯培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，振蕩培養(yǎng)11 h后，按接種量2%轉(zhuǎn)接25瓶50 ml/250 ml肉湯培養(yǎng)基，37℃、200 r/min培養(yǎng)，每1 h取樣一次，測定菌液的吸光值，以未接種的培養(yǎng)基作為空白對照。

1.3.3 平板稀釋菌落計數(shù)

菌液采用10倍梯度稀釋,選取3個適當稀釋度，用移液槍吸取100 μl菌液，把菌液分散地滴在肉湯平板上，輕輕轉(zhuǎn)動平板，使菌液均勻分布。每個稀釋度做3個平行。

1.4 培養(yǎng)基組成的優(yōu)化

1.4.1 碳源優(yōu)化試驗

以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎，分別以蔗糖、葡萄糖、玉米粉、麩皮、可溶性淀粉作為碳源，添加量為5.0 g/l。在各組發(fā)酵培養(yǎng)基中接入納豆芽孢桿菌種子液，接種量2%，37℃、200 r/min培養(yǎng)11 h，各組分別活菌計數(shù)。

1.4.2 氮源優(yōu)化試驗

分別以酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、硝酸銨、硝酸鈉作為氮源，添加量均為5.0 g/l。在發(fā)酵培養(yǎng)基中接入納豆芽孢桿菌種子液，接種量2%，37℃、200 r/min培養(yǎng)11 h，測定各組吸光值并活菌計數(shù)。

1.4.3 初始pH值優(yōu)化試驗

在上述培養(yǎng)基優(yōu)化的基礎上,分別調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5,接種量2%,37℃、200 r/min發(fā)酵培養(yǎng)11 h,測定各組吸光值并活菌計數(shù)。

1.4.4 響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，確定Box-Behnken設計的自變量及其取值范圍，以10倍稀釋的發(fā)酵液的OD值為響應值，運用Design Expert 7.0軟件進行3因素3水平的響應面分析，對納豆芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基進行細致優(yōu)化[3]。

1.5 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

采用最優(yōu)培養(yǎng)基配方,對發(fā)酵過程中的接種量、裝液量和發(fā)酵溫度進行優(yōu)化，測定各組吸光值。

1.5.1 接種量的優(yōu)化

分別選取0.5%、1%、2%、3%、4%和5%6個接種量水平，37℃、200 r/min發(fā)酵培養(yǎng)11 h，測定各組吸光值并活菌計數(shù)。

1.5.2 裝液量的優(yōu)化

分別選取30、40、50、60、70 ml 5種裝液量（250 ml三角瓶）水平，37℃、200 r/min發(fā)酵培養(yǎng)11 h，測定各組吸光值并活菌計數(shù)。

1.5.3 發(fā)酵溫度的優(yōu)化

發(fā)酵培養(yǎng)時分別置于30、37、40、42、45℃搖床中，200 r/min發(fā)酵培養(yǎng)11 h,測定各組吸光值并活菌計數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 納豆芽孢桿菌的生長曲線（見圖1）

圖1 納豆芽孢桿菌生長曲線

連續(xù)測定納豆芽孢桿菌發(fā)酵液的吸光值（5倍稀釋），得到納豆芽孢桿菌的生長曲線。由圖1可知，0～3 h為納豆芽孢桿菌生長延遲期，菌體數(shù)量極少；3～11 h為對數(shù)期,菌體數(shù)量急劇增多；在11 h時達到生長的高峰期，在11～16 h時,為納豆芽孢桿菌生長的穩(wěn)定期，菌體生長和死亡保持平衡狀態(tài)；自16 h后細菌數(shù)量開始減少，進入衰亡期。

2.2 碳源優(yōu)化試驗結(jié)果

圖2 不同碳源對納豆芽孢桿菌增殖的影響

將菌株置于不同碳源的培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，進行平板活菌計數(shù)，結(jié)果如圖2?？梢钥闯?，蔗糖對納豆芽孢桿菌增殖最有利，比最初選用的葡萄糖效果更好。以5.0 g/l的蔗糖做碳源，活菌數(shù)達到2.8×109cfu/ml，所以選擇蔗糖作為最佳碳源。

2.3 氮源優(yōu)化試驗結(jié)果

將菌株置于不同氮源的培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng),測定各組OD值,同時進行活菌平板計數(shù),結(jié)果如圖3。可以看出,酵母粉對納豆芽孢桿菌增殖最有利,比最初選用的蛋白胨效果更好。以5.0 g/l的酵母粉做氮源，活菌數(shù)達到5.6×109cfu/ml,所以選擇酵母粉作為最佳氮源。

2.4 培養(yǎng)基初始pH值優(yōu)化試驗結(jié)果

在不同初始pH值中的培養(yǎng)基中,納豆芽孢桿菌增殖情況如圖4,發(fā)現(xiàn)活菌數(shù)隨著初始pH值的升高先增加后降低，在初始pH值為7.0～7.5時，生長得較好。其中在初始pH值為7.0時，活菌數(shù)達到6.3×109cfu/ml。

2.5 Box-Behnken試驗結(jié)果

以碳源（X1）、氮源（X2）和初始pH值（X3）為自變量，以10倍稀釋的發(fā)酵液OD值為響應值（Y），進行響應面分析（因素水平見表1，每組2個重復）并建立納豆芽孢桿菌增殖培養(yǎng)的回歸模型[4]，試驗設計與響應值見表2。

表1 Box-Behnken設計因素水平

表2 Box-Behnken試驗設計及響應值表

運用Design Expert 7.0軟件對表2數(shù)據(jù)進行多元二次回歸擬合，回歸方程如下：

式中：Y——10倍稀釋后發(fā)酵培養(yǎng)基OD值的預測值；

x1、x2、x3——分別代表碳源、氮源、初始pH值的編碼值。

回歸方程的方差分析和可信度分析結(jié)果見表3和表4。

表3 Box-Behnken設計回歸分析結(jié)果

表4 模型可信度分析

由表3可知，回歸模型顯著可靠（P＜0.000 1）；因子X1、X3、、為顯著模型項；而失擬項不顯著（P＞0.05），提示本模型能充分反映實際情況[5]。

由表4可知,模型的決定系數(shù)(R-Squared)為0.980 0,說明預測值與實測值之間具有高度的相關性；校正決定系數(shù)（Adj R-Squared）為0.954 4，說明該模型能解釋95.44%響應值的變化，僅有總變異的4.56%不能用此模型來解釋。因此，回歸方程的擬合程度很好,預測值和實測值之間具有高度的相關性[6]。模型的信噪比(Adeq Precision)為16.724 0，一般來說，模型的信噪比大于4就是較好的模型，進一步說明本模型設計非常成功，即回歸方程給納豆芽孢桿菌的增殖提供了一個較合適的模型。CV(Y的變異系數(shù))表示試驗的精確度，CV值越高，試驗的可靠性越低，本設計試驗中CV值為1.470 0%，數(shù)值較小，說明試驗操作可信。

響應面中各因素交互作用的立體圖及等高線圖見圖5，由圖5可知，模型存在穩(wěn)定點，穩(wěn)定點是極大值點，通過嶺脊分析[7]，得到極大值所對應的各主要因素的編碼值(x1、x2、x3)(-0.116、0.065、0.15)。由公式x1=(X1-30)/5，x2=(X2-8)/2，x3=(X3-7.2)/0.2，得到各主要因素(X1、X2、X3)的實際值為（29.42、8.13、7.23），即碳源添加量29.42 g/l、氮源添加量8.13 g/l、培養(yǎng)基初始pH值7.23。該模型預測的OD值為0.651。

2.6 Box-Behnken回歸模型驗證試驗結(jié)果

由于得到的最佳條件未包括在響應面優(yōu)化的15個試驗中，需進一步驗證。因此，在優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基配方下，即碳源添加量29.42 g/l，氮源添加量8.13 g/l，初始pH值為7.23，在37℃、200 r/min條件下發(fā)酵11 h，然后測定發(fā)酵液OD值和活菌計數(shù)。共重復了3次試驗，每次試驗都設有2組平行，測得發(fā)酵液10倍稀釋后OD值為0.655（此值為平均值）（相應的活菌數(shù)為6.7×109cfu/ml），與試驗預測值0.651非常接近，這表明試驗值和實際值之間具有良好的擬合性，優(yōu)化模型可靠。

2.7 接種量優(yōu)化試驗結(jié)果

圖6 接種量對納豆芽孢桿菌增殖的影響

在不同接種量的培養(yǎng)基中，納豆芽孢桿菌增殖情況如圖6，發(fā)現(xiàn)活菌數(shù)隨著接種量的升高先增加后降低，在接種量為3%時，納豆芽孢桿菌數(shù)達到7.0×109cfu/ml。

2.8 裝液量優(yōu)化試驗結(jié)果

在不同裝液量的培養(yǎng)基中，納豆芽孢桿菌增殖情況如圖7，發(fā)現(xiàn)活菌數(shù)隨著裝液量的增加先升高后降低，在裝液量為50 ml時，達到7.0×109cfu/ml。

2.9 培養(yǎng)溫度優(yōu)化試驗結(jié)果（見圖8）

根據(jù)試驗結(jié)果可知，納豆芽孢桿菌在30～45℃均可生長，但40℃時生長狀況最好。選擇40℃為最佳發(fā)酵溫度，在此條件下，納豆芽孢桿菌活菌數(shù)達到7.5×109cfu/ml。

3 結(jié)論

采用單因素及響應面試驗法，通過測定發(fā)酵液吸光值和平皿活菌落計數(shù)，對納豆芽孢桿菌的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化,最終確定納豆芽孢桿菌最佳增殖培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基為蔗糖29.42 g/l、酵母粉8.13 g/l、檸檬酸鈉1.0 g/l、MgSO4·7H2O 0.2 g/l、K2HPO44.0 g/l、KH2PO46.0 g/l、初始pH值7.23、裝液量50 ml/250 ml、接種量3%、發(fā)酵溫度為40℃、發(fā)酵時間11 h。經(jīng)過一系列優(yōu)化，納豆芽孢桿菌的單位活菌數(shù)可達到7.5×109cfu/ml，為其在各方面的廣泛應用打下良好基礎。

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