銅綠假單胞菌上清液誘導J774細胞凋亡過程中Fas蛋白的表達

孟子卜，柴文戍

(遼寧醫學院附屬第一醫院呼吸內科，遼寧錦州 121001)

銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa，PA)是醫院內感染最常見的致病菌，一旦感染，治療困難。巨噬細胞是機體重要的免疫防御細胞，細菌侵襲機體組織，首先要避免被巨噬細胞等機體免疫細胞的吞噬、清除。因此激發巨噬細胞凋亡對細菌而言很重要。近來研究顯示，PA以劑量依賴和時間依賴的方式誘導U937巨噬細胞凋亡，且與線粒體途徑有關［1］。本研究采用J774細胞作為巨噬細胞的模型［2］，通過觀察PA上清液誘導J774細胞凋亡過程中Fas蛋白的表達，進一步探討PA上清液誘導J774細胞凋亡的致病機制，為開發新型抗感染藥物提供重要的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 PA采用標準菌株ATCC27853，由遼寧醫學院提供。J774細胞由中國醫學科學院提供。Hoechst 33258凋亡試劑盒購自大連寶生物技術有限公司，Annexin-V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物公司，兔抗鼠Fas抗體購自北京中杉生物技術有限公司。

1.2 方法 PA用LB培養基培養，通過增菌，離心，過濾獲得上清液。J774細胞置于CO2培養箱中培養。使J774細胞與PA上清液0.15的濃度混合3、6、9 h獲得感染的J774細胞。采用熒光染色觀察細胞凋亡形態，Annexin-V-FITC/PI雙染分析測定細胞凋亡率，Western blot法測定Fas蛋白含量。

1.3 統計學分析 統計數據以SPSS 13.0軟件進行分析，數據以±s表示，采用單因素方差分析進行統計學處理，兩組比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 熒光染色 感染3 h時，就可見到少量的凋亡細胞;6 h時，細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化;9h時，產生凋亡小體。

2.2 Annexin-V-FITC/PI雙染分析 對照組，實驗3、6、9 h組的細胞凋亡率見Tab 1。組間比較差異均有統計學意義(P均＜0.01)。

Tab 1 Rate of apoptosis of J774(±s)

Tab 1 Rate of apoptosis of J774(±s)

＊＊P＜0.01 vs control

Time/h Annexin-V-FITC/PI/% 0 4.51±0.76 3 27.91±1.63＊＊6 42.85±2.34＊＊9 68.60±2.30＊＊

2.3 Western blot法測定Fas蛋白含量 對照組，實驗3、6、9 h組Fas蛋白表達相對值見Tab 2。與對照組比較差異均有統計學意義(P均＜0.01)。

Tab 2 Relative expression value of Fas protein

3 討論

目前對于PA感染巨噬細胞發生凋亡的信號轉導途徑，國內外研究還很少。已有研究顯示，各種因素誘導的細胞凋亡均出現線粒體功能紊亂［3］，但是否有Fas/Fas L死亡受體途徑參與目前尚不清楚。

對于Fas/Fas L死亡受體途徑誘導細胞凋亡的分子機制已經進行了較深入的研究［4］。本實驗通過Western blot法檢測Fas蛋白，證明與Fas/Fas L死亡受體途徑與PA上清液誘導J774細胞凋亡過程有關。

綜上所述，PA上清液誘導巨噬細胞凋亡可能與Fas/Fas L死亡受體途徑有關。因此尋找抑制Fas/Fas L死亡受體途徑的藥物治療各種PA相關性疾病有著良好的應用前景。

［1］ 朱小敏，柴文戍.銅綠假單胞菌感染誘導U937細胞凋亡的研究［J］.中國病原生物學雜志，2008，3(4):263－5.

［1］ Zhu X M，Chai W S.The research of Pseudomonas aerugionsa-induced apoptosis of U937 cells［J］.China Pathog Biol J，2008，3 (4):263－5.

［2］ Zhang J L，Takayama H，Matsuba T，et al.Induction of apoptosis in macrophage cell line，J774，by the cell-free supernatant from Pseudomonas aeruginosa［J］.Microbiol Immunol，2003，47(3): 199－206.

［3］ 吳 靜，楊國棟，路 紅，等.D-氨基葡萄糖衍生物誘導Eca-109凋亡的機制［J］.中國藥理學通報，2008，24(1):33－6.

［3］ Wu J，Yang G D，Lu H，et al.Effect of derivatives of D-aminoglucose on the reactive oxygen species and mitochondrial membrane ptoential change of Eca-109 cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(1):33－6.

［4］ Gehring S，Rottmann S，Menkel A R，et al.Inhibition of proliferation and apoptosis by the transcriptional repressor Mad1.repression of Fas induced caspase 8 activation［J］.J Biol Chem，2000，275 (14):10413－43.