大鼠骨髓間充質干細胞生物學特性的研究

徐金霞 李家鋒 韓建國 管海虹 崔 群 孫秀英

1.徐州醫學院口腔醫學院，江蘇徐州 221004；2.徐州醫學院附屬徐州市立醫院口腔頜面外科，江蘇徐州 221002

1968年，Friedenstein等[1]首先發現在骨髓的體外培養中含有少量梭形貼壁細胞，繼續培養一段時間后，可見細胞形成類似骨和軟骨的細胞團塊。Owen等[2]研究也發現骨髓中存在貼壁的細胞集落，并將其命名為成纖維樣細胞集落形成單位。經過大量的研究證實，骨髓中確實存在這類細胞，被稱為骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs），它是一種未充分分化的類中胚層細胞，與骨、軟骨及神經等組織的起源具有相關性，可在特定的條件下定向誘導分化為成骨細胞、軟骨細胞、神經樣細胞等，具有來源廣泛，免疫排斥反應較輕，具有可自體移植和異體移植等優勢[3-4]。但是，骨髓中BMSCs的含量極少。本研究采用密度離心法和全骨髓貼壁法，對BMSCs進行體外分離、培養，觀察其增殖及生長的特性。旨在建立一種對BMSCs進行分離、培養及鑒定的實驗方法，并對其生物學特征進行觀察，為進一步體外BMSCs向成骨細胞分化奠定基礎，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

低糖DMEM/F12培養基（10%胎牛血清＋0.1%青鏈霉素，Gibco，Ameriean）；胎牛血清（杭州四季青生物有限公司）；胰蛋白酶（碧云天生物有限公司）；青鏈霉素（碧云天生物有限公司）；PBS緩沖液（北京中杉金橋公司）；CD29-FITC、CD90-FITC、CD34-FITC兔抗鼠抗體（Biolegend公司，美國）；CCK-8（同仁化學研究所，日本）。

1.2 實驗動物

3周齡健康清潔級SD大鼠，4只，體重約18～20 g，由徐州醫學院實驗動物中心提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠BMSCs的分離培養 應用頸椎脫臼法處死大鼠，于0.5%的碘伏溶液中浸泡3 min，在無菌條件下取其雙側股骨和脛骨，PBS漂洗一遍，用含10%胎牛血清的PBS沖洗骨髓腔，收集沖洗液于15 mL離心管中，2 000 rpm離心10 min，吸取中間白色絮狀單核細胞層，所得細胞按1×108/mL密度接種于25 cm×25 cm塑料培養瓶中，加入3～5 mL低糖DMEM/F12培養基，吹打均勻，于37℃，5% CO2培養箱孵育。

1.3.2 大鼠BMSCs原代培養 將培養瓶置于37℃，5%CO2飽和濕度下培養5 d，首次更換培養基，棄去未貼壁細胞，此后每2～3天換液1次，倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化。

1.3.3 大鼠BMSCs傳代培養 倒置顯微鏡下觀察，當原代細胞處于80%～90%融合階段時進行傳代培養，一般2～3 d傳代1次。吸除培養瓶內培養基，加入2 mL PBS漂洗一遍，再向瓶內加0.25%的胰蛋白酶2～3 mL，消化收集細胞。在室溫下，把培養瓶放在倒置顯微鏡下觀察，當發現細胞質回縮至細胞近圓形時，直接加入5 mL DMEM/F12培養基，低糖DMEM/F12培養基立即終止消化。1 200 rpm離心5 min，棄上清液，加入低糖DMEM/F12培養基，混勻，把細胞懸液分成等份分裝入數個培養瓶中，按1︰3的比例傳代。

1.3.4 大鼠BMSCs表面標志物的檢測 取生長良好的第3代細胞BMSCs，待細胞鋪滿培養瓶80%左右時，吸掉培養基，用0.25%胰蛋白酶室溫消化1～2 min，將貼壁細胞消化分離，1 200 rpm離心5 min后收集細胞，用細胞計數板計數細胞量，PBS漂洗2遍，用PBS懸浮細胞，密度為1×106/mL，將收獲的BMSCs按每支流式管2×104個分別和CD29-FITC、CD90-FITC、CD34-FITC單抗反應，設立1支空白對照組，在37℃水溫箱中水浴、避光反應30 min，PBS漂洗1遍后，應用流式細胞儀（FCM）進行表面抗原的鑒定，應用WinMDI2.9軟件分析結果。

1.3.5 大鼠BMSCs的生長與增殖曲線 取4塊96孔板，將第1、3代細胞以5×103/cm2的密度各接種于每塊培養板的6個孔中，每孔加入低糖DMEM/F12培養基100 μL，在其周圍空白孔中只加入低糖DMEM/F12培養基100 μL作為空白對照孔，置于37℃，5%CO2培養箱中培養，實驗孔和對照孔每3天換液1次。此后每2天固定時間，隨機抽取1板，測定光吸收值（OD）。測量時每孔加入CCK-8溶液10 μL以后，繼續在37℃，5%CO2培養箱中培養1～2 h后，觀察培養基顏色變化，直至培養基變為橙色，酶聯免疫測定儀設定檢測波長492 nm，測定OD值。取6孔OD值的均值，以時間為橫坐標，以實驗孔OD值與空白對照孔OD值差值的均數為縱坐標，應用SPSS16.0軟件繪制細胞生長曲線。

1.4 統計學處理

采用SPSS16.0統計軟件建立數據庫，計量資料采用（x ± s）表示，應用獨立樣本t檢驗，檢驗水準α=0.05，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠BMSCs的細胞形態學觀察

在原代培養換液之前，倒置顯微鏡下觀察，可見大量血細胞懸浮在培養基中。第5天，首次換液見貼壁細胞大部分呈圓形、橢圓形、部分細胞伸出偽足變成紡錘形或梭形，見圖1。隨著換液非貼壁細胞被逐漸清除；隨著細胞的生長、分化，第8～10天可見其形態大部分呈梭形，細胞呈單層生長并鋪滿整個培養瓶底。傳代后細胞擴增分化，第3代呈梭形，排列規則，見圖2。傳至第8代時，細胞增殖能力有所下降，細胞形態發生明顯改變，大部分呈不規則形，排列紊亂，呈樹枝狀，見圖 3。

圖1 大鼠BMSCs原代培養第5天觀察結果（×100）

圖2 大鼠BMSCs傳代培養第3代觀察結果（×100）

圖3 大鼠BMSCs傳代培養第8代觀察結果（×100）

2.2 大鼠BMSCs的表面抗原的鑒定

對大鼠第3代細胞進行FCM檢測，結果顯示CD29的表達率為94.97%，CD90的表達率為88.50%，CD34的表達率為2.23%，見圖4。結果表明分離培養的第3代細胞表型均一，基本符合BMSCs的表型特點。

2.3 大鼠BMSCs體外培養生長曲線的測定

CCK-8法測定細胞活性并繪制第1、3代細胞增殖曲線，兩組生長曲線近似倒S形。接種后第2～4天細胞活性略降低，經過2～3 d的潛伏期后進入對數生長期，約在第6天到達平臺期，第8天細胞出現生長抑制。實驗組第3代細胞比對照組第1代細胞增殖速度顯著加快，兩組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖5。

A：空白對照組；B：CD29；C：CD90；D：CD34圖4 BMSCs表面抗原CD29、CD90及CD34的表達

圖5 第1、3代BMSCs生長曲線

3 討論

BMSCs是一類具有多向分化潛能的組織干細胞，具有強大的自我復制能力，在組織工程領域得到廣泛應用[5]。對BMSCs研究的不斷深入，為解決骨、軟骨、神經細胞來源匱乏的難題提供了新領域。但是，骨髓中BMSCs含量很低，約為0.001%～0.010%，因此，BMSCs的誘導分化成功與否取決于是否能夠實現其體外的分離、培養及擴增。近年來，BMSCs的常用分離方法包括密度離心法、全骨髓培養法、流式細胞儀法和免疫磁珠法。由于流式細胞儀法及免疫磁珠法成本較高、對細胞損傷大，較少使用。骨組織工程理想的種子細胞應該具備以下特點：（1）來源廣泛，取材容易；（2）具有較強的自我更新能力；（3）在體外和體內易于向成骨細胞定向分化；（4）能適應支架材料和受區的微環境。本研究采用了密度離心法及全骨髓貼壁法，所得到細胞經傳代培養，可獲得形態均一，排列規則，生長穩定的第3代細胞，為實現BMSCs體外快速擴增提供實驗依據，也為其成骨誘導分化奠定了基礎。

然而，迄今關于BMSCs的鑒定尚無公認的金標準。盡管BMSCs與造血干細胞共同存在于骨髓中，卻不表達造血細胞的表面抗原。已有研究報道，BMSCs的表面標志具有非專一性，主要有 CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD105、SB-10、SH-3、SH-4等多種表面抗原標志呈陽性，不表達骨髓造血干細胞的表面標志，主要有CD34，CD45等[6-7]。本研究檢測了分離得到的細胞的表面標志CD29的表達率為94.97%，CD90的表達率為88.50%，CD34的表達率為2.23%，此結果與以往文獻報道相吻合[8-9]，與細胞形態學相結合，表明分離培養的細胞為BMSCs。由于BMSCs表面標志的非特異性，還沒有篩選BMSCs特異性的分子標志，因此其鑒別主要依據形態學和表面標志相結合的方法進行綜合判斷。總之，本研究所采用的密度離心與全骨髓貼壁法是一種行之有效的分離大鼠BMSCs的方法，該細胞具有增殖能力較強，純度較高的特點，可以作為組織工程的種子細胞，為BMSCs成骨誘導分化提供理論依據，為骨組織工程的臨床應用帶來了曙光。

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