基于毛細管液滴微陣列的分析檢測

付廣春 ，瞿祥猛

（廈門大學，a.物理與機電工程學院；b.薩本棟微米納米技術研究院；福建 廈門 361005）

微陣列技術是一項進行核酸檢測的有力工具，已被廣泛應用于多個領域。不過微陣列的制作和核酸的雜交過程，均需昂貴的設備和較長的時間。在微流控芯片上進行微陣列分析，能夠有效地克服這些不足，但是密度低，探針數目少，嚴重限制了基于微流控芯片的微陣列分析的應用。

微陣列技術廣泛應用于核酸、細菌、結腸直腸癌等的檢測及臨床診斷[1]。從廣義上講，一切以微芯片為基礎的生物分析過程，均可稱為微陣列技術。

1 微芯片技術簡介

微芯片，是近年來迅速發展的新技術，是一個跨學科的新領域，涉及生命科學、物理學、光學和微機電加工等技術。

根據結構特點和工作原理，可將微芯片分為微陣列芯片和微流控芯片兩大類。

其中，微陣列芯片，也稱基因芯片，相對發展較早，技術已經比較成熟，主要以生物技術為基礎。在芯片表面，高密度地固定一系列可尋址的識別分子陣列，可以用來進行高通量的生物樣品檢測，獲取大量的相關信息，其檢測系統一般為高靈敏的熒光掃描系統[2～3]。

微流控芯片，主要是以微機電加工技術為依托，根據需要，可在玻璃、單晶硅、金屬等材料基底上，刻蝕各種不同的微管道網絡或設計各種開關、閥門等，在微小通道中進行生物樣品的反應、分離、提純等實驗。

二者在核酸的檢測方面，都發揮了很大的作用，是核酸檢測一個非常重要的平臺。但是，微陣列的制作和核酸的雜交過程，均需昂貴的設備和較長的時間[6]，而基于微流控芯片的微陣列分析，由于密度低、探針數目少等，嚴重限制了其廣泛的應用。

針對以上缺點，本研究提出了一種基于毛細管的微陣列分析技術為基礎的核酸檢測方法：將不同的探針通過自動進樣系統引入到毛細管中[7]，沿毛細管形成有機相間隔的一維液滴陣列，液滴中的探針，固定到毛細管的內壁上之后，將樣品引入到毛細管中，并與探針陣列進行雜交反應，然后進行雜交檢測。

通過實驗表明，本方法能夠顯著減少制作成本，有效縮短分析時間，并降低對昂貴設備的依賴，為核酸檢測提供了一個方便快捷的新方法。

2 試驗方案原理

如1所示，為液滴陣列形成的裝置圖。

圖1 在毛細管內形成液滴陣列的裝置示意圖

在CD形的圓片上，裝有末端開口的小試管，由步進電機驅動做圓周轉動。毛細管通過小試管的末端開口，插入到溶液內，毛細管的另一端，與一微量注射泵相連，將小試管內的溶液依次引入到毛細管中。

末端開口的小試管間隔，裝有探針溶液和有機相載流，引入到毛細管內就形成了有機相間隔的探針液滴陣列。毛細管預先進行過醛基化處理，液滴內的探針分子會擴散并被固定到毛細管內壁上。經過清洗和還原后，將熒光標記的核酸樣品引入到毛細管內，樣品分子與探針陣列進行雜交反應。反應完成后，使用熒光掃描儀對毛細管進行掃描，并收集熒光信號進行分析。

3 不同有機相對探針固定的影響分析

本試驗中，將不同種類的探針陣列固定于毛細管以及減少探針之間的交叉污染，是一項很重要的內容。因此，選取合適的載體，來實現探針之間的間隔，顯得尤為重要。我們根據熒光信號背景強度、擴散速率、溶液粘性等因素，考察分析了3種有機相，試驗數據如下：

靶控輸注系統(target control infusion, TCI)采用藥代動力學模型來控制全身麻醉期間鎮靜藥和阿片類藥物的血漿或效應部位濃度[1]。在成人中，最廣泛使用的藥代動力學模型由Marsh等和Schnider等開發；這些模型在健康的非孕人群中的使用已較為成熟，但是否適用于產婦目前尚不清楚[2]。

圖2 不同濃度探針與樣品在毛細管內雜交后的熒光信號強度圖LINE-1為丁醇間隔；LINE-2為戊醇間隔；LINE-3為己醇間隔

圖 2 為 5 μM（物質的量濃度 1 μM=1 μmol/L）濃度AD探針在200 μm內徑的毛細管內用不同的有機相進行間隔固定一夜，然后用100 nM（物質的量濃度，1 nM=1 nmol/L）的D’Cy3樣品進行雜交的熒光信號強度圖。

LINE-1為丁醇間隔；

LINE-2為戊醇間隔；

LINE-3為己醇間隔。

結果表明：戊醇背景信號比己醇低，熒光信號比丁醇的高。丁醇因探針溶液隨著時間的延長與丁醇相互擴散，從而熒光信號弱。與己醇相比，丁醇和戊醇粘性較大，在進行探針清洗后，有部分的己醇附著在毛細管內壁，而進行樣品雜交后，附著在毛細管內壁上的己醇吸附部分帶熒光的樣品，使背景信號增強。

有機相在水中的溶解度越小，越不易使毛細管中液體發生相對移動，越有利于探針的固定。而丁醇在水中溶解度較大，達7.7%，戊醇、己醇相對較小，分別為1.7%與0.6%。綜合考慮，選擇戊醇作為間隔相。

4 結果分析與討論

實驗分別使用了兩種不同的探針（AB和AD）和Cy3標記的核酸樣品（B’Cy3和D’Cy3），其中AB（AD）分別與 B’Cy3（D’Cy3）所包含的堿基序列互補配對。堿基序列如下：

探針 AD：5'-NH2-（CH2）6-CGC CGA TTG GAC AAA ACT TAA A-3'；

AB：5'-NH2-（CH2）6-CGC CAG AGA ATA CCA AAA CTC-3'。

核酸樣品 B’Cy3：5'-Cy3-GAG TTT TGG TAT TCT CTG GCG-3'；

Oligo sample D'Cy3：5'-Cy3-T TTA AGT TTT GTC CAA TCG GCG-3'。

將探針（AD）沿毛細管固定在毛細管內壁上，形成間隔的探針陣列后，在合適的溫度下，將樣品（D’Cy3）引入到毛細管中與一維的探針陣列雜交5 min。熒光掃描結果如圖3(A)中的小圖所示，沿毛細管方向黑色的矩形方塊被灰色的背景間隔，其中黑色方塊是雜交斑點，灰色的區域為背景（即固定時有機相載流所處的位置）。

沿著紅線得到的連續4個雜交斑點的熒光強度如圖 3（A）所示。在圖 3（B）中，25 μM 的 AB 與 AD被引入到毛細管內并形成探針陣列，然后分別與不同濃度的樣品進行雜交反應。可以看到，所得到的熒光信號隨著樣品濃度的增加而增強，樣品的檢測限達到10 pM（物質的量濃度，1 pM=1 pmol/L）。

圖3 探針陣列與樣品雜交后的熒光信號效果

圖3 （A）為固定在毛細管壁的探針陣列與熒光標記的樣品雜交后，所得的熒光掃描結果（小圖）和沿著紅線的熒光強度變化（大圖）；

圖3（B）為25 μM的探針探針陣列與不同濃度的樣品雜交后所得的熒光信號強度。

試驗表明，檢測一個樣品只需較短的時間（不到10 min），并且在毛細管密閉的環境中進行探針的固定和核酸的雜交，能夠提供一致的反應條件，并有效排除外界的干擾和污染，實現穩定和一致的雜交。

5 結束語

本文提出了一種在毛細管內形成液滴陣列的方法，通過制作探針陣列，以進行核酸檢測。這一方法，能夠有效降低微陣列的制作和分析成本，實現快速和高靈敏度的檢測，不僅能用于核酸檢測，也能用于其他分析，如多肽、蛋白質、免疫、藥物以及細胞等，有著廣泛的潛在應用前景。

[1]Hashimoto,M.,Barany,F.,Soper,S.A.Polymerase chain reaction/ligase detection reaction/hybridization assays using flowthrough microfluidic devices for the detection of low-abundant DNA point mutations[J]Biosens.Bioelectron.2006，（21）：1915-1923.

[2]邢婉麗，程 京.生物芯片技術[M].北京：清華大學出版社，2004.

[3]馬立人，蔣中華.生物芯片（第二版）[M].北京：化學工業出版社，2002.

[4]林炳承，秦建華.微流控芯片實驗室[M].北京：科學出版社，2006.

[5]Manz A，Graber N，Widmer H M．Miniaturized Total Chemical Analysis Systems:A novel Concept for Chemical[J].Sensing.Sensors and Actuators B:Chemical，1990，1(1-6)：244-248.

[6]C.A.Koch,P.C.H.Li,R.S.Utkhede.Evaluation of thin films of agarose on glass for hybridization of DNA to identify plant pathogens with microarray technology[J].Anal.Biochem.,2005,（342）：93-102.

[7]Du Wen-Bin,Sun Meng,Fang Qun,et al.Automated Microfluidic Screening Assay Platform Based on Drop Lab[J].Anal.Chem.,2010,（82）：9941-9947.