遺傳轉化中誘導蓖麻子葉節分化適宜的PGR條件

王文躍 ，陳永勝 ，李國瑞 ，黃鳳蘭 ，尚雨絲 ，王 超 ，張智勇

（1.內蒙古民族大學，內蒙古 通遼 028000；2.內蒙古自治區高校蓖麻產業工程研究中心，內蒙古 通遼 028000）

蓖麻（Ricinus communis L.）屬大戟科蓖麻屬，是世界10大油料作物之一，對航天、航空、農業、醫藥、化工等行業都有突出的貢獻[1-7]。

目前，國內外蓖麻優良品種較少、研究水平較低，隨著科學技術的不斷發展，基因工程技術對蓖麻新品種開發起到了積極的作用。Sujatha等[8]使用農桿菌介導法，首次獲得基因組中整合了外源基因的蓖麻植株；Malathi等[9]用與Sujatha等相同的方法將CryI Ab基因轉入蓖麻中，獲得抗擬尺蠖的蓖麻轉基因植株。國內外對蓖麻基因組的研究較多，黃鳳蘭等[10]構建了含有蓖麻毒蛋白A鏈基因的正義和反義重復表達載體，為獲得低毒乃至無毒蓖麻奠定了基礎；王亞等[11]通過ISSR擴增技術建立了適合單雌蓖麻的反應體系，為篩選單雌性狀相關基因提供技術支持。

轉基因蓖麻新品種獲得需要一套完整的遺傳轉化體系，且蓖麻較其他植物缺乏植株再生能力和極低的增殖率而使其快繁體系建立困難重重。適當的PGR種類及濃度配比在植物生長中起著積極的作用，能夠有效地加快蓖麻再生的效率。Sujatha等[12]發現，TDZ對叢生芽的形成有突出作用；張利明等[13]利用6-BA，有效地提高了外植體的芽增殖率；黃鳳蘭等[14]以ZT和NAA培養蓖麻子葉節，能有效地預防蓖麻子葉節玻璃化。

本研究在黃鳳蘭等[14]研究的基礎上，以蓖麻子葉節為外植體，設置不同質量濃度的ZT和NAA，IAA，IBA處理農桿菌浸染的蓖麻子葉節，探索蓖麻子葉節再生最適發芽與生根的激素質量濃度，旨在建立蓖麻遺傳轉化中離體快繁體系。

1 材料和方法

1.1 試材與試劑

通蓖5號種子購于通遼市農業科學院；玉米素（ZT）、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）、瓊脂、乙酰丁香酮、卡那霉素均購于Sigma公司；蔗糖、無水乙醇、升汞、MS培養基均購于國內公司。

1.2 方法

1.2.1 誘導材料準備 根據黃鳳蘭等[10]的研究，取當年粒大、飽滿的蓖麻種子經培養后，選淡黃色時期的子葉節預培養3 d，農桿菌浸染10min（不斷地搖動農桿菌菌液），再接到原培養基進行共培養（一般為7 d）。

1.2.2 激素濃度篩選

1.2.2.1 誘導芽篩選

1.2.2.1.1 ZT和NAA不同質量濃度配比誘導芽篩選 設ZT質量濃度為0，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0mg/L，NAA質量濃度為 0，0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 mg/L，共36個處理，32顆材料，3次重復，記錄30d時的生長狀態。每升培養基：1/8 MS＋蔗糖20g＋瓊脂10g＋乙酰丁香酮5.00mg＋卡那霉素2.50mg，pH值為5.6～5.8。以相同質量濃度配比誘導未進行農桿菌浸染的子葉節作為對照。

1.2.2.1.2 ZT和NAA低質量濃度配比誘導芽最適篩選 根據1.2.2.1.1結果設定ZT質量濃度為0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0，2.4 mg/L，NAA 質量濃度為 0，0.03 ，0.06，0.09，0.12，0.15 mg/L，共 42 個處理，40顆材料，3次重復，記錄30d時的生長狀態。每升篩選培養基：1/8 MS＋蔗糖20g＋瓊脂10g＋乙酰丁香酮5.00mg＋卡那霉素2.50mg，pH值為5.6～5.8。

1.2.2.2 誘導根篩選

1.2.2.2.1 NAA不同質量濃度配比誘導根篩選

設 NAA的質量濃度為 0，0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30mg/L，共 7 個處理，30顆材料，3 次重復，記錄30d時的生長狀態。每升培養基：1/8 MS＋蔗糖20g＋瓊脂10g，pH值為5.6～5.8。

1.2.2.2.2 NAA，IAA，IBA低質量濃度配比誘導根最適篩選 根據1.2.2.2.1結果設定NAA質量濃度為 0，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12，0.14，0.16 mg/L。IAA，IBA的質量濃度梯度與NAA的質量濃度梯度相同，35顆材料，3次重復，記錄30d時的生長狀態。每升篩選培養基：1/8 MS＋蔗糖20g＋瓊脂 10g，pH 值為 5.6～5.8。

2 結果與分析

2.1 誘導芽篩選結果

2.1.1 ZT和NAA不同質量濃度配比誘導芽的初篩選結果 由表1可知，ZT的質量濃度為0～2.0mg/L時的總芽誘導率明顯高于其他質量濃度，所以，ZT的質量濃度為0～2 mg/L時適宜蓖麻子葉節發芽；NAA的質量濃度在0.15 mg/L以下時有助于芽誘導；農桿菌浸染的子葉節對卡那霉素有抗性，其生長狀態明顯要好于未浸染的子葉節。在此基礎上需要進一步篩選，尋找更加適宜的蓖麻子葉節芽誘導的ZT與NAA質量濃度配比。

表1 ZT和NAA不同質量濃度配比誘導芽的初篩選

2.1.2 ZT和NAA低質量濃度配比誘導芽的最適篩選結果 從表2可以看出，與初篩選結果一致，不添加NAA比添加NAA芽誘導率要高出許多，在處理編號為 1，3，7，13，25，31 中的芽誘導率與生長狀態都要好于其他處理，其中，處理編號為31的更為突出，故只添加ZT且質量濃度為2 mg/L時，最有利于蓖麻子葉節芽的誘導（圖1-A）。

表2 ZT和NAA低質量濃度配比誘導芽的最適篩選

2.2 誘導根篩選結果

2.2.1 NAA不同質量濃度配比誘導根的初篩選結果 由表3可知，處理編號為1，3，4的根誘導率較高，且NAA質量濃度在0～0.15 mg/L時的總根誘導率較其他質量濃度高，且與未進行農桿菌浸染的子葉節處理相比，生長狀態也較好，所以，低質量濃度的NAA有助于蓖麻子葉節的根誘導。但此時的根誘導率較低，應該篩選出更加適宜蓖麻子葉節誘導根的激素與激素質量濃度，以求得到更多的轉化苗，提高蓖麻組織培養效率。2.2.2 NAA，IAA，IBA低質量濃度配比誘導根的最適篩選結果 NAA，IAA和IBA不同質量濃度組合最適篩選生根結果如表4所示。由表4可知，添加IBA的根誘導率要明顯好于添加NAA或IAA，則IBA為最適根誘導PGR；當IBA質量濃度為0.10，0.16 mg/L時的根誘導率較高，且生長狀態較好。但考慮到節省資源，則選IBA質量濃度為0.10mg/L時最適根誘導（圖1-B）。

表3 NAA不同質量濃度配比誘導根的初篩選

表4 NAA，IAA，IBA低質量濃度配比誘導根的最適篩選

3 結論與討論

理想的遺傳轉化再生體系應該適合于各種基因型，這為蓖麻分子育種帶來了契機。通過建立蓖麻高效遺傳轉化體系，可以有效地提高蓖麻再生的速率，進而縮短蓖麻培育新品種的年限。本試驗在黃鳳蘭等[14]研究的基礎上，對影響蓖麻子葉節再生過程中，芽和根誘導的最適PGR種類及其質量濃度進行了探索。結果表明，在只添加ZT且質量濃度為2 mg/L時最適芽的誘導；IBA為最適根誘導的PGR，其0.1 mg/L為蓖麻子葉節最適根誘導質量濃度。農桿菌浸染后的子葉節對卡那霉素具有抗性，這為子葉節再生后的篩選工作節省了工作時間。

本研究以蓖麻子葉節進行離體初代培養，有利于誘導新芽，并且芽是直接從外植體的芽點處萌發產生的，此培養途徑有利于再生植株保持原母本的遺體性狀。以蓖麻子葉節為外植體，誘導生根的關鍵優點在于，根系直接從皮層長出，其整個培養過程中不產生愈傷組織，這種根系便于從基質中吸收水分、養分，有利于再生苗的成活和生長，同時也加大了在轉置土壤中的幾率。本試驗對適宜蓖麻組織培養中PGR的種類及質量濃度進行了探討，為進一步深入研究提供參考。

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