山東壽光地區(qū)番茄黃化曲葉病毒外殼蛋白基因克隆及其在大腸桿菌中的表達

喬 寧 李美芹* 郭寶太 劉永光 裴華麗 竺曉平

（1 濰坊科技學院蔬菜花卉研究所，山東壽光 262700；2 青島農業(yè)大學生命科學學院，山東青島266109；3 山東農業(yè)大學植物保護學院，山東泰安 271018）

番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）屬于雙生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus），主要通過煙粉虱（Bemisia tabaci）傳播，可以侵染茄科、豆科等多種植物（Harrison et a1.，1977；Harrison & Robinson，1999），是分布廣泛的世界性番茄病毒之一。由TYLCV 引起的番茄黃化曲葉病毒病是一種毀滅性病害，自1964年發(fā)現(xiàn)以來，已給許多國家和地區(qū)造成了嚴重危害（Hanley-Bowdoin et a1.，1999；Moriones & Navas-Castillo，2000）。

番茄（Lycopersicon esculentumMill．）是山東省壽光市種植面積最大的蔬菜品種之一，常年種植面積達1.3 萬hm2。自2009年起在壽光主要番茄種植區(qū)相繼發(fā)現(xiàn)疑似番茄黃化曲葉病毒病的病害，該病害傳播速度快，危害程度高，致使受災面積達7 000～8 000 hm2，給番茄生產帶來了巨大的經(jīng)濟損失（龔一帆，2009；劉國霞 等，2009）。因此，應盡快建立快速有效的TYLCV檢測方法。張玉滿等（2001）對番茄黃化曲葉病毒（TYLCV-CHI）外殼蛋白基因在大腸桿菌中的表達進行研究，證實了以病毒外殼蛋白基因的原核表達產物為抗原制備抗血清是一條行之有效的途徑。本試驗克隆了壽光地區(qū)TYLCV 分離物的外殼蛋白（CP）基因，并構建其原核表達載體，實現(xiàn)了目的基因的高效表達，為抗血清的制備奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 病株采集

2009～2011年在山東省壽光市蔬菜研究院番茄種植基地及壽光市稻田鎮(zhèn)、田柳鎮(zhèn)的番茄種植區(qū)進行調查，采集番茄植株頂部卷曲黃化及矮縮等具有典型癥狀的葉片樣本10 份；陽性對照由浙江大學生物技術研究所謝艷老師惠贈；健康植株是由山東農業(yè)大學植物保護學院竺曉平老師提供的番茄組培苗。試驗在濰坊科技學院蔬菜花卉研究所植物生理生化實驗室完成。

1.2 工具酶及化學試劑

pEASY-T1 Simple 克隆試劑盒、T4-DNA 連接酶均購自北京全式金生物技術有限公司；XhoI和EcoR I 限制性內切酶、DNA Marker、中等分子量標準蛋白均購自MBI 公司；植物基因組DNA提取試劑盒、2xTaqMasterMix、Ni2+-NTA 親和層析柱、堿性磷酸酶標記二抗、BCIP（5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽）/NBT（四唑硝基藍）底物顯色試劑盒均購自北京康為世紀生物科技有限公司；硝酸纖維素膜、抗His 標簽單克隆抗體和IPTG 均購自Sigma 公司，其余試劑均為國產分析純。

1.3 載體及宿主菌

原核表達載體pET-32a 由山東農業(yè)大學植物保護學院竺曉平老師惠贈，E.coliDH5α（用于克隆載體的轉化）、E.coliBL21（DE3）（用于表達載體的轉化）感受態(tài)細胞均購自北京全式金生物技術有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 DNA 提取 取番茄病葉，按照試劑盒說明書提取植物總DNA。

1.4.2 病原PCR 分子鑒定 根據(jù)雙生病毒共同區(qū)及外殼蛋白基因保守序列設計簡并引物PA 和PA：5′-TAATATTACCKGWKGVCCSC-3′；PB：5′-TGGACYTTRCAW GGBCCTTCACA-3′。PCR 反應體系：2xTaqMasterMix 12.5 μL；10 pmol·L-1PA 1.0 μL；10 pmol·L-1PB 1.0 μL；模板DNA 1.0 μL，加ddH2O 至終體積25.0 μL。PCR 反應條件為94 ℃變性45 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)，72 ℃繼續(xù)延伸10 min。PCR 產物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

擴增產物經(jīng)回收純化后送上海生工生物工程技術服務有限公司測序，并用DNAMAN 及NCBI網(wǎng)站上的BLAST 程序進行比對分析。

1.4.3TYLCV-CP基因克隆 根據(jù)TYLCV-CP基因序列設計并合成引物TYCP1 和TYCP2，序列分別為 5′-GCGGAATTC ATGTCGAAGCGACCAGGCGAT-3′、5′-GCGCTCGAGATTTGATTTGAA TCATAG-3′，下劃線部分為酶切位點。內切酶分別為EcoR I，XhoI。所有引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

以提取的總DNA 為模板進行PCR 擴增，反應體系為：2xTaqMasterMix 12.5 μL，10 pmol·L-1TYCP1 1.0 μL，10 pmol·L-1TYCP2 1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，加ddH2O 至終體積25.0 μL。PCR 反應條件為94 ℃變性1 min，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35 個循環(huán)，72 ℃繼續(xù)延伸10 min。PCR 產物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，經(jīng)純化與pEASY-T1 Simple 載體連接，轉入大腸桿菌DH5α，提取質粒，經(jīng)PCR 和酶切鑒定獲得的重組克隆pT1-CP。

1.4.4TYLCV-CP基因原核表達載體的構建 用EcoR I 和XhoI 將TYLCV-CP基因從克隆載體pT1-CP 上切下，定向插入到同樣雙酶切的pET-32a，經(jīng)PCR 和酶切篩選陽性克隆，并將其命名為p32a-CP。提取該重組質粒送上海生工生物工程技術服務有限公司測序，根據(jù)測序結果分析重組表達載體中TYLCV-CP基因序列及讀碼框的正確性。

1.4.5TYLCV-CP基因在大腸桿菌中的誘導表達與純化 將重組載體p32a-CP 和pET-32a 分別轉入大腸桿菌BL21（DE3），挑取單菌落接種到LB 液體培養(yǎng)基〔含20 ug·mL-1Amp（氨芐青霉素）〕中，37 ℃培養(yǎng)過夜，將上述培養(yǎng)物接種于新鮮的LB 液體培養(yǎng)基（含20 ug·mL-1Amp）中，37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.8 時，加入終濃度為0.1～1.0 mmol·L-1的IPTG，37 ℃誘導表達4 h，取1 mL 離心收集菌體，12% SDS-PAGE 電泳檢測表達結果。將重組質粒p32a-CP 擴增培養(yǎng)至100 mL 后誘導表達，離心收集菌體，經(jīng)超聲破碎后用Ni2+-NTA 親和層析柱純化目的蛋白，具體操作按照親和層析柱產品說明書進行。

1.4.6 Western blot 鑒定重組蛋白 表達產物經(jīng)12%的SDS-PAGE 凝膠電泳后，經(jīng)電轉移到硝酸纖維膜上，轉移結束后，用5%脫脂牛奶37 ℃封閉轉移膜1 h；與1 000 倍稀釋的6×His 標簽單克隆抗體室溫孵1 h；洗膜，用堿性磷酸酶標記二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h；洗膜，用BCIP/NBT底物進行顯色反應，陽性條帶出現(xiàn)后立即用蒸餾水漂洗中止反應，拍照保存。

2 結果與分析

2.1 病原PCR鑒定

從采集的10 份病樣中任取3 份，分別提取番茄總DNA，并以此為模板利用雙生病毒簡并引物PA/PB 進行PCR 擴增，結果如圖1所示，3 份樣品均得到500 bp 左右的目的條帶，與陽性對照的片段大小一致，而健康番茄樣品中無此條帶。BLAST 分析測序結果顯示，該片段序列由 541 個堿基組成，與孫海霞等（2009）、褚棟等（2010）已發(fā)現(xiàn)的番茄黃化曲葉病毒具有極高的同源性（97%～99%），因此可以說明番茄病葉由TYLCV 壽光分離物侵染所致。

2.2 TYLCV-CP 基因克隆

以病葉總DNA 為模板進行PCR 擴增，電泳結果顯示得到約770 bp 的特異性擴增條帶，與預期結果一致。重組質粒pT1-CP 經(jīng)EcoR I 和XhoI 雙酶切以及以該重組質粒為模板，TYCP1/TYCP2 為引物進行PCR 擴增，均得到約770 bp 的目的條帶（圖2），說明克隆得到了TYLCV-CP基因的特異性DNA 片段。

圖1 感染TYLCV 番茄病葉DNA 的PCR 擴增結果

2.3 原核表達載體的構建及鑒定

經(jīng)EcoR I 和XhoI 雙酶切的TYLCV-CP基因正確插入到表達質粒pET-32a 中，獲得了陽性克隆p32a-CP。重組質粒經(jīng)PCR 擴增與EcoR I、XhoI 雙酶切后，均可見約770 bp 的目的片段，而在EcoR I 和XhoI 單酶切圖譜上都只有1 條約6.6 kb 的DNA 條帶（圖3）。測序結果表明（圖4），該序列包含了TYLCV-CP基因的774 bp 編碼序列，編碼268 個氨基酸，與表達載體pET-32a連接正確，沒有發(fā)生移碼，堿基沒有改變，同GenBank 中報道的相關序列完全一致，其登錄號為FN256257（Zhang et al.，2009）。

圖2 重組質粒pT1-CP 的酶切及PCR 鑒定結果

圖3 原核表達載體p32a-CP的酶切及PCR鑒定結果

圖4 TYLCV-CP 基因全序列及推導的氨基酸序列

2.4 重組蛋白的誘導表達與純化

將鑒定正確的重組質粒 p32a-CP 轉入E.coliBL21（DE3），經(jīng)IPTG 誘導4 h 后，12%SDS-PAGE 分析可見明顯的蛋白表達條帶，其大小為50 kD，是19 kD 硫氧還蛋白與推測的31 kD 的外殼蛋白分子量之和（圖5）。而未經(jīng)誘導的含有重組表達質粒的菌株無此條帶。通過分析全菌蛋白和超聲波破碎后上清液的電泳圖譜發(fā)現(xiàn)，TYLCV-CP基因的表達產物主要以包涵體的形式存在。通過凝膠掃描分析，目的蛋白的表達量約占細菌總蛋白的25%。經(jīng)Ni2+-NTA 親和層析柱純化后，SDS-PAGE 電泳顯示洗脫物中有清晰單一的特異性蛋白條帶，獲得了高純度的目的蛋白（圖6）。

圖5 TYLCV-CP 基因在大腸桿菌中的表達結果

2.5 重組蛋白的Western blot 分析

將表達產物轉至硝酸纖維素膜上進行Western Blot 檢測，通過圖7 可以看出泳道2 和5 所表達的蛋白條帶位置上有明顯的雜交條帶，而菌體蛋白條帶的位置（泳道3 和4）沒有出現(xiàn)雜交條帶；另外，泳道 1 中的目的蛋白含量非常少，故未出現(xiàn)較明顯的雜交條帶。表明壽光地區(qū)TYLCV-CP基因在E.coliBL21（DE3）中得到了融合表達，具有良好的免疫原性。

圖6 TYLCV-CP 基因表達產物的純化分析

圖7 重組蛋白的Western blot 分析

3 結論與討論

通過田間調查發(fā)現(xiàn)番茄黃化曲葉病毒病已在山東壽光地區(qū)大面積發(fā)生，并有繼續(xù)蔓延的趨勢。紀文磊等（2010）發(fā)現(xiàn)，山東壽光地區(qū)的番茄黃化曲葉病毒與上海、安徽、日本登錄的番茄黃化曲葉病毒的同源性達到了99%，屬TYLCV-Israe l 株系的一個分離物。

本試驗采用了超聲波法提取細菌總蛋白，SDS-PAGE 電泳結果顯示上清液中目的蛋白含量較少，而得到的沉淀經(jīng)尿素溶解后能純化出單一目的蛋白條帶，說明表達的重組蛋白主要以包涵體的形式存在，這可能與表達量過高、表達條件不夠完善等因素有關；盡管目的蛋白的N 端融合了硫氧還蛋白，但仍出現(xiàn)了不可溶現(xiàn)象，而安乃莉等（1999）發(fā)現(xiàn)硫氧還蛋白（TrxA）可促進外源蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達，這就需要下一步通過優(yōu)化表達條件來提高CP 蛋白的可溶性。

目前國內針對番茄黃化曲葉病毒的檢測主要是何自福等（2004）、葉青靜等（2008）應用的PCR 法，但該法技術含量高、設備昂貴，不適合進行大量樣品的田間檢測。在實際生產中對大量樣品檢測的方法主要是ELISA 法（薛朝陽 等，1999；謝艷 等，2002），而大量制備特異性的抗血清是應用該方法的前提。傳統(tǒng)方法多采用提純的病毒粒子為抗原制備抗血清，但存在一些弊端。據(jù)Neo 等（1993）報道，病毒外殼蛋白具有良好的抗原特異性。利用基因工程技術克隆病毒外殼蛋白，并以此為抗原制備抗血清，能夠克服常規(guī)途徑的諸多困難，已成為病毒抗血清制備的新途徑，該途徑現(xiàn)成功應用于煙草（朱常香 等，2005）、辣椒（吳育鵬 等，2010）、黃瓜（陳紅運 等，2007）、甜菜（姚華建 等，1994）等多種植物病毒的血清學檢測，但關于番茄黃化曲葉病毒的相關研究還比較少。本試驗已成功構建了TYLCV-CP基因的原核表達載體，下一步將制備針對目的蛋白的特異性抗血清，為TYLCV 的ELISA 檢測方法的建立奠定基礎。

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