甜瓜自交系不定芽再生過程中內(nèi)源激素含量的變化

張慧君 欒非時(shí) 王學(xué)征 高 鵬 牛明明

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

離體形態(tài)發(fā)生是高等植物生長發(fā)育研究中一個(gè)復(fù)雜的問題，受多種內(nèi)外因素的影響，至今尚未徹底掌握其規(guī)律。植物激素對(duì)形態(tài)發(fā)生起著重要的作用，外植體離體培養(yǎng)形態(tài)建成，往往需要外源激素的誘導(dǎo)。然而，外源植物激素必須通過對(duì)內(nèi)源激素平衡的調(diào)節(jié)才能起作用（李代麗和康向陽，2007）。植株生長發(fā)育過程與植株內(nèi)源和外源激素的種類、含量及配比等有密切關(guān)系，裴東等（1997）、邵繼平（2003）、Zhang 等（2008）、田春英等（2010）、Huang 等（2012）的研究表明，內(nèi)源激素對(duì)紅富士蘋果、菊花、水稻愈傷、南瓜不定芽形成和分化起重要作用；目前關(guān)于甜瓜（Cucumis meloL.）再生過程中內(nèi)源激素的研究還未見報(bào)道。本試驗(yàn)擬對(duì)甜瓜子葉節(jié)外植體的不同內(nèi)源激素含量及其在離體培養(yǎng)過程中的變化進(jìn)行研究，以了解甜瓜在離體培養(yǎng)條件下內(nèi)源激素的變化規(guī)律，為合理添加外源激素以誘導(dǎo)甜瓜離體形態(tài)發(fā)生提供理論依據(jù)和技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2010年9月～2011年1月在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)西甜瓜分子育種實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。供試甜瓜品系M1-16、M1-15、M1-19、M1-23 均來自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)西甜瓜分子育種實(shí)驗(yàn)室，均為純合自交系，分別編號(hào)為品系1、品系2、品系3、品系4。其中再生能力強(qiáng)弱依次為品系4＞品系2＞品系1＞品系3。

1.2 方法

無菌苗的培養(yǎng)：取籽粒飽滿、大小均一的甜瓜種子，溫湯浸種4～5 h，流水沖洗，在超凈工作臺(tái)上先用75%酒精浸泡1 min，再用0.1% HgCl2溶液浸泡10～15 min，輕輕搖動(dòng)，最后用無菌水沖洗5～6次，將種子平放于1/2 MS 培養(yǎng)基（每升含蔗糖30 g、瓊脂7 g，pH值5.8）上。28℃暗培養(yǎng)1～2 d，50%種子露白后轉(zhuǎn)至光照下培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25℃，光照16 h·d-1、黑暗8 h·d-1，光照強(qiáng)度為40 μmol·m-2·s-1。

不定芽的誘導(dǎo)：取5 d 左右兩片子葉脫離種皮、但未完全張開的甜瓜無菌苗，切去生長點(diǎn)及下胚軸，兩片子葉均切去上半部分（1/2～1/3），留取子葉下半部分，將子葉節(jié)接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，MS+1.0 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1IAA（Zhang et al.，2011）；培養(yǎng)條件同上。然后分別取接種培養(yǎng)0 d、7 d（啟動(dòng)分化時(shí)期）、14 d（芽原基形成時(shí)期）、21 d（不定芽膨脹時(shí)期）、28 d（不定芽開始伸長時(shí)期）的葉片用液氮速凍，置于-70℃冰箱中保存待測。

1.3 生理指標(biāo)的測定

內(nèi)源激素含量的測定采用酶聯(lián)免疫法，試劑盒由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)提供；每一指標(biāo)的測定均重復(fù)3次，應(yīng)用DPS 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)源激素含量的變化

2.1.1 內(nèi)源IAA含量的變化 如圖1所示，不定芽誘導(dǎo)過程中甜瓜各品系間內(nèi)源IAA 的含量變化較大。4個(gè)品系在幼葉、不定芽形成過程中內(nèi)源IAA含量經(jīng)歷了由高到低的變化過程，但品系間有明顯差異。0 d時(shí)品系1 和品系4 IAA含量較高，0～7 d 急速下降，7 d 以后下降趨于平緩；品系3 一直呈緩慢下降趨勢；品系2 則0～7 d 稍有上升，隨后下降。

2.1.2 內(nèi)源ABA含量的變化 由圖1可以看出，雖然各甜瓜品系間在不同培養(yǎng)階段內(nèi)源ABA 的含量存在較明顯的差異，但均隨著不定芽誘導(dǎo)進(jìn)程而呈現(xiàn)高—低—高的變化趨勢。在誘導(dǎo)初始階段，各品系內(nèi)源ABA含量均急劇減少，其中品系4 在7 d時(shí)最低。品系1、品系2 和品系4變化趨勢相近，而品系3 內(nèi)源ABA含量在21 d時(shí)又很快回升，此時(shí)品系4 ABA含量最低。品系4 內(nèi)源ABA含量在7～28 d 一直保持較低水平。

圖1 甜瓜自交系不定芽再生過程中內(nèi)源激素含量的變化

2.1.3 內(nèi)源ZR含量的變化 4個(gè)甜瓜品系在不同培養(yǎng)階段內(nèi)源ZR含量及變化幅度差別較大（圖1）。品系4 不定芽再生過程中的內(nèi)源ZR含量均顯著高于其他品系，在第14 天達(dá)到最高值，然后下降；其他3個(gè)品系ZR含量都比較低。可見較高的ZR含量有利于再生。

2.1.4 內(nèi)源GA3含量的變化 由圖1可以看出，0 d時(shí)4個(gè)甜瓜品系內(nèi)源GA3含量均為最高值，其中品系4 GA3含量最高，品系3 最低，可見，此時(shí)的GA3含量與品系再生能力有一定的聯(lián)系。隨著愈傷組織誘導(dǎo)和再生植株分化，內(nèi)源GA3含量逐漸下降，啟動(dòng)分化期（0～7 d）的下降幅度較大。第21 天時(shí)品系2、品系4 GA3含量略微回升。

圖2 甜瓜自交系不定芽再生過程中內(nèi)源激素比值的變化

2.2 IAA/ZR、IAA/ABA、ZR/ABA 的變化

甜瓜子葉節(jié)在組培過程中內(nèi)源激素含量不斷變化，進(jìn)而使得 IAA/ZR、IAA/ABA、ZR/ABA 的比值也不斷發(fā)生變化，不同品系間也有較明顯的差異（圖2）。0 d時(shí)品系4 IAA/ZR的比值最低，而且一直保持較低水平。0 d時(shí)，品系4 IAA/ABA 出現(xiàn)最高值，且在21 d 和28 d時(shí)也比其他品系都高；21 d時(shí)品系3 IAA/ABA值最低，可見，較低的IAA/ABA值不利于再生。品系4 ZR/ABA 的比值在整個(gè)再生過程一直保持較高水平，可見ZR/ABA 的比值與再生率呈正相關(guān)。

2.3 子葉節(jié)接種不同時(shí)期的變化

從圖3可以看出，品系4 子葉節(jié)接種7 d 左右細(xì)胞開始啟動(dòng)分化，以后進(jìn)行旺盛分裂，到14 d時(shí)即形成芽原基，21 d時(shí)外植體上形成肉眼可見的不定芽。品系4 ZR/ABA 的比值遠(yuǎn)高于其他品系，特別是在啟動(dòng)分化時(shí)期，這表明在此階段內(nèi)源ZR含量占有絕對(duì)優(yōu)勢，而其內(nèi)源ABA含量較少。可見，為了獲得足夠的再生植株，在此階段應(yīng)保持較高的細(xì)胞分裂素水平。

圖3 甜瓜自交系（品系4）子葉節(jié)不定芽再生的不同時(shí)期

3 結(jié)論與討論

從本試驗(yàn)不同時(shí)期各外植體的IAA 水平來看，甜瓜子葉節(jié)接種0 d時(shí)保持相對(duì)較高的IAA水平，有利于形成芽原基，這與前人的觀點(diǎn)（郭子彪和蓋均鎰，1997；陶靜 等，1998；Ali et al.，2009）相同。GA3在形成啟動(dòng)分化時(shí)期含量急劇下降，到了中后期含量變化不大，可見甜瓜形成不定芽前對(duì)GA3的需求量較大，而在不定芽形成后GA3含量變化相對(duì)平穩(wěn)，這與Jiménez 和Bangerth（2001）對(duì)胡蘿卜的試驗(yàn)結(jié)果一致。ABA含量在不定芽誘導(dǎo)初期明顯下降而后有所上升，中后期品系4 一直保持很低的水平，可見在形成不定芽后其含量的下降有利于芽的進(jìn)一步生長。品系4 ZR含量一直保持較高水平，14 d時(shí)最高，說明較高的ZR含量有利于不定芽的誘導(dǎo)，但是一旦芽原基形成，其需求量也隨之降低，只需維持不定芽的生長即可，這與朱麗華等（2006）關(guān)于大白菜下胚軸愈傷組織不定芽發(fā)生過程的研究結(jié)果相似。

植物體的各種生理效應(yīng)是內(nèi)源激素相互作用的結(jié)果（肖關(guān)麗和楊清輝，2001），不同種類植物激素的生理效應(yīng)相互促進(jìn)或相互拮抗，一種激素的變化往往伴隨著多種激素的相應(yīng)變化，不定芽再生過程中引起形態(tài)變化的某一個(gè)反應(yīng)往往是多種激素間綜合作用的結(jié)果。本試驗(yàn)結(jié)果表明，較易再生的品系4 的內(nèi)源IAA/ZR 的含量一直較低，而ZR/ABA 在整個(gè)再生過程中一直保持較高水平，表明較低的IAA/ZR 比值和較高的ZR/ABA 比值有利于甜瓜子葉節(jié)的再生。4個(gè)甜瓜品系的IAA/ABA 在0 d時(shí)比值均處在較高水平，而后下降，不同品系間差異不明顯。

植物離體培養(yǎng)的器官發(fā)生受到植物體內(nèi)環(huán)境和外部培養(yǎng)條件的影響，其中內(nèi)源激素的調(diào)控非常重要，外源激素必須通過對(duì)內(nèi)源激素的調(diào)節(jié)來達(dá)到控制器官發(fā)生的目的，各種生長調(diào)節(jié)物質(zhì)都通過影響培養(yǎng)物的基因表達(dá)從而影響器官分化（黃學(xué)林和李莜菊，1995）。而內(nèi)源激素需要與受體或載體結(jié)合，通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和傳遞方式的不同而控制不同的生理功能，本試驗(yàn)只是研究了甜瓜不定芽產(chǎn)生的不同時(shí)期內(nèi)源激素含量和比值與甜瓜再生能力之間的關(guān)系，但這些激素在分子水平上通過何種途徑來調(diào)控甜瓜再生的作用機(jī)制仍有待深入研究。

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