同種異體骨髓間充質干細胞移植治療急性心肌梗死的實驗研究

楊文奇，毛淑丹，陶貴周

(遼寧醫學院附屬第一醫院，遼寧錦州121000)

急性心肌梗死(AMI)是目前我國發病率、病死率較高的重大疾病之一，AMI后可致大量無功能心肌形成，梗死區域最終被瘢痕組織代替并逐步發生心室重構而導致心力衰竭，其最基本的病理改變是具有完整舒縮功能的心肌細胞壞死或凋亡致瘢痕組織形成。目前，再灌注療法在臨床中廣泛開展，雖可使閉塞血管再通，但無法使已壞死的心肌細胞再生。干細胞是一類具有自我更新和分化潛能的細胞，其分化方向和分化能力是全能的，可形成包括所有組織的有機體。隨著生命科學的發展，干細胞移植替代壞死心肌己成為目前心肌梗死治療領域備受關注的熱點。2010年6月～2012年6月，本研究觀察了同種異體骨髓間充質干細胞(BMMSCs)移植治療AMI的療效，評價其對梗死區毛細血管增生和非梗死區心肌細胞凋亡的影響，以探討BMMSCs治療AMI的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 成年雌性Wistar大鼠30只，體質量(215±25)g，由遼寧醫學院實驗動物中心提供。LDMEM、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶均購自美國GIBCO公司，4，6二脒基-2-苯吲哚(DAPI)(Sigma公司)，TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒(南京凱基生物科技發展有限公司)，CO2恒溫培養箱(美國Heraeus公司)，熒光倒置顯微鏡(Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與模型制作 將大鼠隨機分成2組:BMMSCs移植組(15只)、培養液注射組(15只)。采用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，氣管插管連接小動物呼吸機。在心電監護下于胸骨正中縱向切口開胸，打開心包，暴露心臟，結扎左冠狀動脈前降支，結扎后即刻可見遠端心肌缺血左室前壁心肌變蒼白，術后ECG兩個或兩個以上導聯出現J點抬高0.2 mV以上，并持續30 min以上，或新出現的明顯Q波表示AMI模型制作成功。術后給予抗生素預防感染。

1.2.2 BMMSCs的分離、培養、標記與移植 取健康Wistar大鼠3只，頸椎脫臼處死，75%的乙醇消毒10 min，無菌條件下分離大鼠股骨及脛骨，從股骨干和脛骨干兩端剪斷，用磷酸鹽(PBS)緩沖液反復沖洗骨髓腔，沖洗液經200目不銹鋼標準篩過濾掉大的團塊后充分吹打混勻獲取細胞懸液。收集細胞懸液并將其轉入15 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min。棄上清液，加入含10%FBS的α-MEM培養液重懸，以1× 106/cm2密度接種于25 cm2的培養瓶中，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中培養。48 h后更換培養液，以后每2～3天換液1次。細胞長到80%～90%融合時用0.25%胰蛋白酶消化傳代，收集第4代BMMSCs，將1 mL用L-DMEM培養基配制的DAPI (終濃度為50 mg/L)加入骨髓細胞懸液中，置于37℃、5%CO2飽和濕度的CO2培養箱中孵育40 min。PBS反復洗滌6次，除去未殘留的DAPI，離心收集細胞，用無血清L-DMEM制成細胞懸液1 mL，含MSCs 1 ×107個，BMMSCs移植組大鼠于心肌梗死后1周再次開胸將0.2 mL BMMSCs共2×106個注射到心梗部位及周圍［1］，分5點注射，梗死四周及中央，注射后注射部位局部隆起，顏色變白;培養液注射組開胸后于梗死區中心及周圍注射等量的細胞培養液。

1.2.3 左心功能測定 AMI模型制備成功后第4周由同一資深超聲技術人員采用超聲測量實驗鼠的左室收縮末期內徑(LVEDs)、左室舒張末期內徑(LVEDd)、左室射血分數(LVEF)。

1.2.4 免疫組織化學測定毛細血管密度 完成上述測定后處死大鼠，取出心臟，PBS沖洗，去除左右心房和右心室，垂直于心臟長軸，平行于心臟短軸將心臟組織切成3塊，每塊組織厚約2 mm，標記清楚后，分別行10%中性甲醛固定、石蠟包埋，然后切片，在熒光顯微鏡下觀察DAPI藍色標記的陽性供體細胞。鏡下計算心肌梗死區毛細血管密度，每張切片隨機取10個400倍視野，取平均數作為測定值。

1.2.5 心梗周圍非缺血區心肌細胞凋亡TUNEL分析 每個心臟標本的3個組織蠟塊各取切片1張，進行TUNEL染色分析。TUNEL陽性反應:細胞核呈棕黃色顆粒者為染色陽性的凋亡細胞，其他細胞核為藍色。

1.2.6 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件，數據以s表示，組間兩兩比較采用t檢驗。以P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠BMMSCs培養的生長情況 原代培養的細胞，接種48 h可見部分細胞已經開始變形貼壁，多呈短梭形或橢圓形，并逐漸呈集落樣生長。5～12 d細胞生長迅速，貼壁細胞體積增大，仍呈梭形，有粗大突起伸出，有些細胞則呈三角形或多角形，核居中，有1～2個核仁，出現較大集落樣生長，14 d左右細胞生長達80%融合即可傳代，以后每3～4天傳代一次。傳代后細胞形態較為均一，呈梭形。DAPI標記的BMMSCs胞核呈藍色，標記率達100%，造模后4周可在BMMSCs移植組大鼠心肌梗死區發現大量DAPI標記陽性細胞，胞核呈藍色。見圖1。

圖1 BMMSCs移植前后的DAPI標記情況

2.2 兩組左心功能指標比較 見表1。

表1 兩組左心功能指標比較(s)

表1 兩組左心功能指標比較(s)

注:與培養液注射組比較，*P＜0.05

組別 n LVEF(%) LVEDs(mm)LVEDd(mm) BMMSCs移植組 15 46.80±9.20*3.72±0.50* 5.85±0.40*培養液注射組15 33.50±7.60 6.15±0.40 7.25±0.60

2.3 兩組毛細血管密度比較 AMI造模后4周，BMMSCs移植組心肌梗死區毛細血管密度為(13.24 ±1.27)個/HP，對照組為(3.45±0.72)個/HP，兩組比較P＜0.05。

2.4 心梗周圍非缺血區域心肌細胞凋亡TUNEL分析結果 BMMSCs移植組大鼠心肌梗死區域凋亡細胞明顯少于培養液注射組。

3 討論

目前報道的BMMSCs移植方式主要有經靜脈移植、經冠脈移植及心內膜下移植［2］。有實驗比較了上述3種方式的移植效率，發現經靜脈移植組的動物心外器官中滯留的BMMSCs數量顯著高于其他兩組，移植成功率較低;而冠脈移植組動物心肌梗死區域中BMMSCs的數量則顯著高于另外兩組，但經冠脈移植組遠端血流降低最明顯，甚至在無病變區域也出現心肌灌注減少的現象，這可能是因BMMSCs的直徑與毛細血管的直徑相似，使BMMSCs流經毛細血管時造成阻塞所致。因此，這也可能會在一定程度上削弱經冠脈移植的優勢。在本實驗中，我們采取經心內膜下注射干細胞的方式進行移植，BMMSCs移植組大鼠心功能明顯好于培養液注射組，與有關報道［3］結果相似。考慮可能與心內膜下注射時，BMMSCs可在梗死部位形成干細胞團有關［4］。至于干細胞移植治療 AMI的最佳移植時機為AMI發生后1～2周［5］，這可能是因為:一方面AMI發生后的最初幾天是心肌的損傷修復期，此時損傷的心肌會產生嚴重的炎癥反應，如在此時植入干細胞，其很可能是參與到炎癥反應中，而不是參與心肌的再生和血管的形成;另一方面，若移植時間的間隔過長，心肌瘢痕生成過多，則不利于移植細胞在梗死區域的擴散。AMI發生后1周左右，炎癥反應明顯減輕，同時壞死心肌的周邊聚集的大量黏附分子、趨化因子和細胞基質因子是干細胞在心肌損傷區域聚集分化的必要條件。因此，本實驗采取在心肌梗死后1周進行干細胞移植。

本試驗中，造模4周后行心臟超聲檢查發現BMMSCs移植組大鼠LVEDs和LVEDd顯著降低，LVEF明顯增加。處死大鼠后，熒光顯微鏡下BMMSCs移植組大鼠心肌梗死區可見大量DAPI標記的陽性細胞，同時觀察到BMMSCs移植組大鼠梗死區毛細血管密度明顯大于培養液注射組，而心肌梗死區域凋亡細胞明顯少于培養液注射組。上述觀察結果證實，細胞移植后大鼠心臟結構功能的改善與MSCs在心肌梗死局部存活分化為心肌樣細胞，減少梗死區心室壁變薄，增加局部收縮功能有關;同時BMMSCs移植組大鼠梗死區毛細血管密度的增加同樣證明干細胞除了分化為心肌細胞外，尚可分化為血管內皮細胞，促進損傷局部毛細血管的再生，以增加心肌灌注改善心功能，與Tang等［6］研究結果一致。細胞凋亡是細胞的程序性死亡，是與壞死截然不同的死亡方式。近年研究表明，心肌細胞凋亡是心肌梗死后心力衰竭發生發展過程中非梗死區心肌收縮單位不斷喪失的主要原因，心肌細胞的凋亡參與了AMI后心衰的基本病理生理進程［7］。在本研究中，就非梗死區域的心肌細胞凋亡率而言，BMMSCs移植組明顯低于培養液注射組。而BMMSCs移植組心梗局部毛細血管密度明顯多于培養液注射組，因此推測，心肌細胞調亡的減少與心梗局部毛細血管密度增加有關。

在本實驗中，對AMI大鼠經心肌注射BMMSCs達到了預期的結果，但是本實驗樣本量較小，觀察時間較短，有必要增加樣本量，延長觀察時間，以進一步證實BMMSCs移植在AMI治療中的安全性及有效性。相信隨著更多的基礎理論研究以及臨床研究的深入，干細胞移植會有更為廣闊的研究范圍和應用前景。

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