miR－21通過下調PTEN增強人腦膠質瘤細胞對卡莫司汀耐藥*

胡 婷， 陳梅香， 翁澤平， 謝思明， 鐘雪云

(暨南大學醫學院病理學系，廣東廣州510632)

腦膠質瘤是腦內最常見的原發性腫瘤，侵襲性強、惡性進展快，目前，主要采取外科手術聯合放、化療的綜合策略進行治療。卡莫司汀［carmustine，1，3 -bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea，BCNU］是一種烷化劑，屬于亞硝基脲類藥物，因其高脂溶性和易于通過血腦屏障的特性，被公認為是治療腦膠質瘤的標準化療藥物［1］。然而，原發性耐藥和獲得性耐藥的產生已成為其化療失敗的主要原因。原發性耐藥和獲得性耐藥的機制復雜且不盡相同，目前相關研究多集中在原發性耐藥方面，獲得性耐藥的具體機制尚不太清楚。

近年來，發現了一類具有轉錄后調控作用的小分子、非編碼的微小RNA(microRNA，miRNA)在腫瘤中異常表達，并能以癌基因或抑癌基因角色參與腫瘤發生發展。人類成熟miRNA至少調控著30%的人類蛋白質編碼基因。miRNA在膠質瘤的發生、發展以及耐藥等過程中也具有重要作用。具有原癌基因作用的微小RNA-21(microRNA-21，miR-21在腦膠質瘤中常呈過度高表達狀態［2］，其能影響細胞增殖能力及細胞對多種化療藥物的敏感性，但miR-21在人腦膠質瘤耐BCNU過程中的作用和機制尚不清楚。另外，本實驗室從人腦膠質瘤細胞系SWO38中克隆出兩株亞系SWOZ1(BCNU原發性耐藥株)和SWOZ2(BCNU敏感株)，并通過BCNU誘導SWOZ2獲得了SWOZ2-BCNU細胞株(BCNU獲得性耐藥株)［3-4］。本研究通過實時熒光定量 PCR (real-time fluorescence quantitative PCR，RFQPCR)檢測SWOZ2及SWOZ2-BCNU細胞中miR-21表達水平并分析其與細胞對BCNU敏感度的關系;通過轉染上調SWOZ2中miR-21的表達，進一步探討miR-21在腦膠質瘤對BCNU產生獲得性耐藥過程中可能的作用及機制。

材料和方法

1 材料

1.1 主要材料和試劑 BCNU為天津藥業公司產品;CCK-8(Cell Counting Kit-8)為日本同仁公司產品;Trizol試劑為Invitrogen產品;PrimeScriptTM逆轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM熒光定量PCR試劑盒均為TaKaRa產品;miR-21和U6 snRNA的Bulge -LoopTMmiRNA qRT-PCR Primer Set為廣州銳博公司產品;miR-21 mimics和miRNA mimics negative control為上海吉瑪公司產品;jetPRIMETMTransfection

Reagent為Polyplus Transfection產品;第10號染色體同源缺失性磷酸酶及張力蛋白(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN)和磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B，p -Akt)兔抗人單克隆抗體均為Cell Signaling產品;P -糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)鼠抗人單克隆抗體、0.45 μm硝酸纖維素膜皆為Millipore產品;β-肌動蛋白(β-actin)鼠抗人單克隆抗體、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記山羊抗兔IgG和 HRP標記山羊抗鼠 IgG均為 Protein Tech Group產品;BCA法蛋白質定量試劑盒為海門碧云天公司產品;ECL底物發光檢測試劑盒為Pierce產品。1.2 主要儀器和設備 二氧化碳培養箱為Harris產品;倒置相差顯微鏡為Olympus產品;ELx800自動酶標儀為Bio-Tek產品;MiniOpticon Real-Time PCR System、垂直電泳儀和電轉移儀均為Bio-Rad產品。

2 方法

2.1 細胞培養 人腦膠質瘤細胞株SOWZ2與SWOZ2-BCNU由本實驗室建株并凍存保藏［3-4］，用含10% 胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的RPMI -1640培養基在37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養箱中培養，0.25%胰酶+0.02%EDTA消化傳代。

2.2 RFQ-PCR檢測細胞中miR-21的表達 提取RNA:應用Trizol提取細胞的總RNA，經分光光度計檢測，A260/A280值為1.8～2.1的用于cDNA合成。首先，逆轉錄反應:按說明進行，用PrimeScriptTM逆轉錄試劑盒，反應體系20μL，62.5 nmol/L miR-21及U6 Bulge-LoopTMmiRNA RT Primer各2 μL，反應條件為37℃ 15 min，85℃ 5 s。其次，RFQPCR:反應體系20 μL，SYBR Premix Ex TaqTM10 μL，5 μmol/L Bulge-LoopTMmiR-21或U6 snRNA上、下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，無酶水7 μL，反應條件為95℃預變性20 s，95℃ 10 s，60℃ 20 s，70℃30 s，擴增40個循環。最后，所得數據用2-ΔΔCt評定不同細胞株miR-21相對表達量，ΔCt=CtmiR-21-CtU6，ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組。

2.3 CCK-8檢測BCNU處理后膠質瘤細胞的存活率 將SWOZ2及SWOZ2-BCNU兩種細胞在不含藥物的培養基中培養48 h，以3 000 cells/well接種于96孔板中，每孔200 μL，24 h后待細胞貼壁加入BCNU，設7個呈2倍遞增梯度濃度(2～128 mg/L)、1個不加藥物的對照孔，各種藥物濃度做3個平行孔。培養72 h后，加入10 μL CCK-8試劑，繼續培養4 h后在酶標儀上檢測各孔對波長為450 nm的吸光度(A)，計算細胞存活率，其計算公式為:存活率= (實驗孔A值/對照孔A值)×100%，并通過軟件計算出藥物作用的半數抑制濃度(the half-maximal inhibitory concentration，IC50)。實驗重復3次。

2.4 轉染miR-21 mimics 取狀態良好、對數生長期的SWOZ2細胞消化、計數，以平均每孔5.0×105個細胞種植于6孔板中。實驗組加30 nmol/L miR-21 mimics、200 μL jetPRIMETMBuffer及4 μL jetPRIMETMReagent(命名為轉染組或SWOZ2-miR-21 mimics);陰性對照組是將實驗組中miR-21 mimics換為同濃度的miRNA mimics negative control，余同實驗組(命名為對照組或SWOZ2-miR-control mimics);兩組皆用含5%FBS的RPMI-1640。液調至2 mL。24 h后將培養液更換為含10%FBS的RPMI-1640，轉染步驟嚴格按說明書執行。轉染48 h后，提取各組細胞總RNA用RFQ-PCR檢測miR-21表達量，或提取各組細胞總蛋白用Western blotting檢測相關蛋白表達情況;或在轉染24 h后消化細胞，并按3 000 cells/well接種于96孔板培養12 h，按以上方法用梯度濃度BCNU處理細胞48 h后用CCK-8檢測各組細胞的存活率并計算IC50。

2.5 Western blotting檢測膠質瘤細胞相關蛋白的表達 收集細胞，用RIPA細胞裂解液提取蛋白質樣品。用BCA法在酶標儀上用570 nm波長測定總蛋白濃度。樣本經過SDS-PAGE電泳后，再用電轉儀以350 mA恒流1 h轉印至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入PTEN(1∶1 000)、p-Akt (1∶1 000)、P-gp(1∶500)、內參照 β-actin (1∶2 000)，4℃搖床孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min。再加HRP標記Ⅱ抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。ECL化學發光試劑盒顯影。

3 統計學處理

結果

1 miR－21在細胞中的表達

1.1 miR-21的表達 SWOZ2和SWOZ2-BCNU細胞中miR-21的表達量分別為1.000±0.079、2. 070±0.138，SWOZ2-BCNU細胞中miR-21的表達量明顯高于SWOZ2細胞(P＜0.01)，見圖1。

Figure 1.The relative expression of miR-21 in SWOZ2 and SWOZ2-BCNU cells detected by RFQ-PCR.±s.n=3.＊＊P＜0.01 vs SWOZ2.圖1RFQ－PCR檢測SWOZ2和SWOZ2－BCNU細胞中miR－21的表達

1.2 SWOZ2細胞轉染miR-21 mimics后miR-21的表達 轉染組miR-21的相對表達量(2 112.390 ±273.446)明顯高于對照組(1.000±0.069)(P＜0.01)，見圖2。

Figure 2.The relative expression of miR-21 in SWOZ2 cells transfected with miR-21 mimics or miR-control mimics for 48 h detected by RFQ-PCR.±s.n= 3.＊＊P＜0.01 vs miR-control mimics(control).圖2RFQ－PCR檢測SWOZ2細胞轉染miR－21 mimics或miR－control mimics 48 h后miR－21的表達

2 細胞對BCNU的敏感性

2.1 SWOZ2-BCNU細胞對BCNU的耐藥性高于SWOZ2BCNU處理后SWOZ2-BCNU細胞的存活率高于SWOZ2細胞，見圖3;BCNU對SWOZ2和SWOZ2 -BCNU細胞的IC50分別為(25.160±2.604)mg/L和(58.800±9.264)mg/L，SWOZ2-BCNU細胞對BCNU的耐藥指數為2.34，明顯高于SWOZ2細胞(P＜0.05)，見圖4。

2.2 SWOZ2細胞轉染miR-21 mimics后對BCNU耐藥性的變化 轉染組細胞的存活率高于對照組，見圖5;BCNU對轉染組和對照組細胞的IC50分別為(48.020±0.698)mg/L和(35.460±1.796)mg/L，轉染組細胞對BCNU的耐藥性明顯高于對照組(P＜0.01)，見圖6。

Figure 3.The viability of SWOZ2 and SWOZ2-BCNU cells treated with BCNU for 72 h detected by CCK-8 assay.±s.n=3.圖3CCK－8檢測BCNU處理72 h后SWOZ2和SWOZ2－BCNU細胞的存活率

Figure 4.The IC50of BCNU for SWOZ2 and SWOZ2-BCNU cells 72 h after treatment detected by CCK-8 assay.±s.n=3.*P＜0.05 vs SWOZ2.圖4CCK－8檢測BCNU處理72h后SWOZ2和SWOZ2－BCNU的IC50

3 Western blotting檢測細胞中相關蛋白的表達

3.1 SWOZ2和SWOZ2-BCNU細胞中PTEN、p-Akt和P-gp蛋白的表達 與SWOZ2細胞相比，SWOZ2-BCNU細胞中PTEN蛋白表達量明顯下降(P＜0.01)，而 p-Akt的表達量明顯升高(P＜0.05)，P-gp的表達量也明顯升高(P＜0.01)，見圖7。

Figure 5.The viability of SWOZ2 cells transfected with miR-21 mimics or miR-control mimics 48 h after BCNU treatment detected by CCK-8 assay.±s.n=3.圖5 CCK－8檢測BCNU處理轉染miR－21 mimics或miR－control mimics的SWOZ2細胞48 h后細胞的存活率

Figure 6.The IC50of BCNU for SWOZ2 cells transfected with miR-21 mimics or miR-control mimics 48 h after treatment detected by CCK-8 assay..n=3.＊＊P＜0.01 vs miR-control mimics.圖6 CCK－8檢測BCNU處理48 h后對轉染了miR－21 mimics或miR－control mimics的SWOZ2細胞的IC50

Figure 7.The relative expression of PTEN，p-Akt and P-gp in SWOZ2 and SWOZ2-BCNU cells detected by Western blotting. s.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs SWOZ2.圖7 Western blotting檢測SWOZ2和SWOZ2－BCNU細胞中PTEN和p－Akt的表達

3.2 轉染miR-21 mimics對SWOZ2細胞中PTEN、p-Akt和P-gp表達的影響 與對照組相比，轉染組細胞中PTEN蛋白表達量明顯降低 (P＜0.01)，而p-Akt的表達量則明顯升高(P＜0.01)，P-gp的表達量也明顯升高(P＜0.01)，見圖8。

該結果表明，在miR-21表達上調的細胞中PTEN蛋白表達下降，而p-Akt和P-gp蛋白表達增加。

Figure 8.The relative expression of PTEN，p-Akt and P-gp in SWOZ2 cells transfected with miR-21 mimics or miR-control mimics for 48 h detected by Western blotting.±s.n=3.＊＊P＜0.01 vs miR-control mimics.圖8 Western blotting檢測轉染miR－21 mimics或miR－control mimics 48 h后SWOZ2細胞中PTEN和p－Akt的表達

討論

化療是治療人腦膠質瘤的一種重要手段，耐藥性的產生是其治療的重大障礙。腫瘤細胞的耐藥性包括原發性耐藥和獲得性耐藥。細胞耐藥的主要機制包括:(1)多種糖蛋白介導的藥物外排泵機制，包括P-gp、多藥耐藥相關蛋白(multidrug resistance associated protein，MRP)、肺耐藥相關蛋白(lung resistance-associated protein，LRP)、乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)等，這些蛋白均為能量依賴性藥物外排泵，可將細胞內的藥物轉運出細胞，導致細胞內藥物濃度減低而產生耐藥。(2)酶介導的耐藥機制，包括谷胱甘肽S-轉移酶(glutathione S-transferases，GST)，能催化藥物與谷胱甘肽結合，形成水溶性較高的復合物，促進藥物從體內排泄。拓撲異構酶Ⅱ(topoisomorasesⅡ，TopoⅡ)，能與藥物結合，促進DNA斷裂。蛋白激酶C能誘導多藥耐藥基因1(multidrug resistance-1，mdr1)表達，促進P-gp磷酸化。(3)凋亡調控基因介導的耐藥，其中與耐藥相關的基因有B淋巴細胞瘤2(B -cell lymphoma，bcl－2)、生存素(survivin)、骨髓細胞瘤癌基因(myelocytomatosis oncogene，c－myc);抑癌基因p53及PTEN等抑癌基因。(4)信號轉導通路異常介導的耐藥，如磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B (phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B，PI3K/ Akt)通路及核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)信號轉導通路激活導致的細胞多藥耐藥［5］。但有關耐藥方面的研究多沒有嚴格區分原發性耐藥或是獲得性耐藥，有關腦膠質瘤對BCNU產生獲得性耐藥的機制依然不甚清楚。

新近的研究發現，具有轉錄后調控作用的小分子、非編碼miRNA在細胞的分化、增殖、凋亡、胚胎發育等生命活動中具有重要作用，在腫瘤的發生、發展、侵襲、耐藥以及診斷和預后等方面也具有重要作用。自1993年發現lin-4以來，目前，miRNA基因序列數據庫(http://www.mirbase.org/Release 18: November 2011)已收錄了動植物及病毒等成熟miRNA 18 226條，其中人類的為1 527條。

與小干擾RNA完全互補的作用方式不同，miRNA與靶mRNA的相互作用是以完全互補或部分互補的方式相結合的，一種miRNA可作用于多種mRNA，多個miRNA也可協同作用于同一個mRNA［6］。miRNA可能是基因調控網絡的關鍵節點、可能是腫瘤治療的有效新靶點。

在腦膠質瘤中，miR-21、miR-125b、miR-221、miR-222和miR-10b等17個miRNA呈過度高表達，而miR-7、miR-181a/b/c、miR-124、miR -137和 miR-128等33個 miRNA的表達下調［7-8］。具有原癌基因活性的miR-21位于染色體的脆性區域17q23.2。miR-21在乳腺癌、肝癌以及腦膠質瘤等多種惡性腫瘤中高表達，與腫瘤的惡性分級正相關。在不同級別膠質瘤中，膠質母細胞瘤(glioblastoma，GBM)中miR-21的表達上調最明顯，miR-21可作為GBM的獨立預后指標［9］。敲除GBM細胞中的miR-21，細胞生長受抑、凋亡增強、侵襲能力減弱并可抑制腫瘤的發生。本研究通過RFQ-PCR分析發現，SWOZ2-BCNU細胞(BCNU獲得性耐藥株)中 miR-21的表達量較其親本SWOZ2細胞(BCNU敏感株)明顯升高。為進一步觀察miR-21在膠質瘤細胞對BCNU耐藥過程中的作用，本研究將miR-21 mimics和陰性對照序列分別轉入SWOZ2細胞，繼而用RFQ-PCR檢測兩組細胞miR-21的表達，發現:與對照組相比，轉染組SWOZ2-miR-21-mimics細胞中，miR-21的表達顯著上調，轉染組細胞對BCNU的耐藥性亦明顯升高。這些結果表明，miR-21表達上調后可介導腦膠質瘤細胞對BCNU產生獲得性耐藥。相關研究也發現了類似的結果:Li等［10］在多形性膠質母細胞瘤中發現，抑制miR-21的功能可上調靶因子富亮氨酸重復序列相互作用蛋白1(leucine-rich repeat flightless-interacting protein 1，LRRFIP1)的表達，進而導致NF-κB的活化，導致膠質瘤細胞對化療藥物替尼泊甙敏感性增強;Shi等［11］在U87MG中發現，過表達miR-21可降低Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)和半胱氨酸蛋白酶 3 (caspase-3)的表達、降低Bax/Bcl-2的比值，進而抑制替莫唑胺誘導的凋亡。這些結果表明，腦膠質瘤中miR-21表達的上調可介導細胞對化療藥物耐藥。

在遺傳背景相同的細胞中，miR-21可能是通過轉錄后調控某些蛋白的表達進而介導細胞對BCNU發生獲得性耐藥。有研究發現，在肝細胞癌、乳腺癌等多種腫瘤中，抑癌因子PTEN是miR-21的直接靶標［12］。在腦膠質瘤，特別是高級別的腦膠質瘤中，PTEN基因常發生突變或缺失、PTEN蛋白表達常呈下調或缺失狀態。PTEN蛋白是PI3K/Akt通路的負性調節因子，PTEN可參與引起腦膠質瘤對藥物耐藥［13］。本研究通過Western blotting分析發現，相對于親本細胞SWOZ2而言，在miR-21高表達且耐BCNU的SWOZ2-BCNU細胞中，PTEN蛋白的表達明顯下調，而p-Akt和P-gp的表達卻明顯上調。本研究進一步通過轉染和相關分析，發現:與對照組相比，上調miR-21表達后的轉染組細胞，不僅對BCNU的耐藥性明顯增強，而且其細胞中PTEN蛋白表達明顯下調、p-Akt和P-gp蛋白表達明顯上調。PTEN蛋白是PI3K/Akt通路的負性調節因子，轉染組細胞PTEN蛋白表達下調后可激活PI3K/Akt通路并導致p-Akt表達上調。相關研究也發現:在乳腺癌、白血病中，miR-21能下調PTEN蛋白的表達進而引起細胞對化療藥物耐藥［14-15］;激活p-Akt可上調P-gp進而引起胃癌細胞的多藥耐藥［16］。本研究結果和相關資料表明，在腦膠質瘤細胞中，上調miR-21可降低PTEN蛋白的表達、激活PI3K/Akt通路，繼而上調P-gp表達，進而介導細胞對BCNU耐藥。

BCNU上調miR-21表達的具體機制尚不清楚。BCNU可上調脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)進而增加細胞因子白細胞介素6(interleukin 6，IL-6)等的釋放［17-18］;信號轉導和轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)在多種惡性腫瘤以及腦膠質瘤中高表達，IL-6可通過激活的STAT3靶向上調miR-21促進多發性骨髓瘤細胞的存活［19］。這些資料表明，BCNU或許可通過上調LPS、增加IL-6的釋放繼而激活STAT3，進而上調miR-21的表達。但在BCNU誘導耐藥的SWOZ2-BCNU細胞中，miR-21的表達上調是否由LPS/IL-6/STAT3調控尚需進一步研究。

在膠質瘤中，miR-21還可靶向作用于基質金屬蛋白酶抑制因子Kazal基序逆向誘導半胱氨酸豐富蛋白(reversion-inducing-cysteine-rich protein with Kazal motifs，RECK)、金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)、程序性細胞死亡因子4、異質核核糖核蛋白K、轉錄激活型p63(transcription activation p63，TAp63)和LRRFIP1，參與調節p53、轉化生長因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)、線粒體凋亡、NF-κB、Bcl-2、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)通路等［20］。總之，作為一種致癌基因的miR -21可參與調節多條信號通路中多種腫瘤相關蛋白的表達，進而促進細胞生長、抑制凋亡、提高腫瘤的耐藥性;miR-21可能是基因調控網絡中的關鍵節點，靶作用于miR-21或許能發揮“單擊多靶”效應，miR-21可能是腦膠質瘤等惡性腫瘤治療的一個有效靶標。然而，miR-21在細胞內的分子調控網絡是錯綜復雜的，細胞調控miR-21表達的具體機制仍有待深入探究。

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