葉酸和維生素B12減輕高同型半胱氨酸血癥誘導的老年大鼠阿爾茨海默樣病變*

魏 偉， 陸大祥， 戚仁斌， 王達安

(暨南大學醫學院病理生理教研室，國家中醫藥管理局病理生理學三級科研實驗室，廣東 廣州 510632)

1000-4718(2012)08-1436-05

2012-05-07

2012-06-19

國家自然科學基金資助項目 (No.81100944)；廣東省醫學科研基金資助項目(No.B2011156)；暨南大學博士啟動基金資助項目(No.21611334)

△通訊作者 Tel: 020-85220253; E-mail: rocky1240@163.com

葉酸和維生素B12減輕高同型半胱氨酸血癥誘導的老年大鼠阿爾茨海默樣病變*

魏 偉△， 陸大祥， 戚仁斌， 王達安

(暨南大學醫學院病理生理教研室，國家中醫藥管理局病理生理學三級科研實驗室，廣東 廣州 510632)

目的探討慢性高同型半胱氨酸血癥對老年大鼠腦內 tau 蛋白結構和功能的影響以及其可能機制。方法選取18月齡健康大鼠，尾靜脈注射同型半胱氨酸(Hcy)生理鹽水溶液(1.6 mg·kg-1·d-1)制造高同型半胱氨酸血癥模型組，在給予 Hcy 的同時通過飲用水給予葉酸(4 mg·kg-1·d-1) 和維生素B12(Vit B12,250 g·kg-1·d-1)作為治療組，單純注射生理鹽水作為對照組，持續28周，Bielschowsky 銀染觀察磷酸化 tau 蛋白的分布和聚集；Western blotting 檢測磷酸化 tau蛋白、糖原合酶激酶3β (GSK-3β)和蛋白磷酸酶2A(PP2A)的表達。結果(1)血漿中 Hcy 水平增高導致神經原纖維樣纏結；給予葉酸和Vit B12能夠有效減輕纏結；(2)血漿高 Hcy 水平誘導老年大鼠腦內 tau 蛋白在Ser199/202和Ser396位點磷酸化水平升高；(3)血漿高 Hcy 水平激活 GSK-3β 同時抑制 PP2A 的活性。補充葉酸和Vit B12有效地緩解了這些激酶和酯酶的活性改變，并下調了 tau 蛋白 Ser199/202和Ser396位點的磷酸化水平。結論補充葉酸和Vit B12能夠有效改善高同型半胱氨酸血癥所誘導的 tau 蛋白阿爾茨海默樣病理改變，其機制可能與其抑制GSK-3β活性和激活PP2A有關。

老年大鼠； Tau蛋白; 葉酸; 維生素B12; 阿爾茨海默病

阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)的兩大病理學特征是神經元內的神經原纖維纏結(neurofibrillary tangles，NFTs)和主要存在于細胞外的老年斑(senile plaques, SPs)[1], 神經原纖維纏結主要由異常過度磷酸化的骨架蛋白 tau 構成，但是誘導 NFTs 形成的上游效應目前還沒有完全清楚。同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)是體內提供甲基和轉硫作用的關鍵物質，當體內葉酸和維生素B12[folate and vitamin B12(Vit B12), FB]缺乏時，血漿 Hcy 水平增高就成為一碳轉移反應所需的輔助因子缺乏的直接結果。眾多臨床調查表明，血漿 Hcy 水平升高與 AD 的發生呈正相關，因此高 Hcy 血癥已被提出作為一個獨立的危險因素[2]。Hcy 損壞海馬神經元內的受損DNA修復，使神經元更易受淀粉樣蛋白毒性損壞[3]。但是高同型半胱氨酸血癥對老年大鼠 NFTs 的影響直到現在還沒有報道。因此本次研究使用24月齡的大鼠(相當于人的年齡65歲[4])，探討高同型半胱氨酸血癥誘導的老年大鼠腦內的 tau 蛋白病理改變。我們發現高 Hcy 血癥可導致tau蛋白結構和功能的改變，其機制包括蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)的活性抑制和糖原合酶激酶3β (glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β)被激活。同時補充 FB 可以有效改善高 Hcy 血癥誘導的上述阿爾茨海默氏樣病變。

材 料 和 方 法

1動物

實驗動物為華中科技大學同濟醫學院動物中心提供的SD大鼠，成年雄性，18月齡，體重(500 ± 20) g，在安靜、室溫25 ℃左右、晝夜節律12 h∶12 h的環境下飼養。

2主要試劑

DL-Hcy購于Sigma。p-Ser396抗體購于Biosource，用來檢測 Ser396位點的磷酸化tau蛋白。Tau1抗體購于Chemicon，用來檢測 Ser199/202位點的非磷酸化tau蛋白。Tau5抗體購于NeoMarkers，用來檢測 tau蛋白總量。DM1A購于Sigma，用來檢測α微管蛋白。PP2A-C、p-PP2A-C-Tyr307、GSK3β和p-GSK-3β-Ser9抗體購于Cell Signaling，分別用來檢測PP2A催化亞基C的總量和其Tyr307位點的磷酸化，GSK3β的總量和其Ser9位點磷酸化。葉酸購于Yabang Aipusen，Vit B12購于云鵬有限公司。二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白測定試劑盒、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔Ⅱ抗和化學發光底物(ECL)試劑盒購自Pierce。

3主要方法

3.1AD 樣模型的復制 Hcy 以生理鹽水配制，濃度為400 mg/L。葉酸和Vit B12片劑研磨后溶于大鼠飲用水中[5]。為了建立老年大鼠高 Hcy 血癥慢性模型，我們對18個月齡的大鼠通過尾靜脈注射 Hcy(400 μmol/L，4 mL/kg，每3 d 1次)作為模型組(Hcy,n=20)，同時飲用水補充葉酸(4 mg·kg-1·d-1)和Vit B12的(250 μg·kg-1·d-1)作為治療組(Hcy+FB,n=20)，生理鹽水(NS)注射作為對照組(control,n=20)，注射持續28周。

3.2高壓液相色譜法測定 Hcy 的含量[6]高壓液相所用的所有試劑均用Barnstead純水儀所制的超純水配制并經0.22 μm濾膜過濾。所采集血用肝素抗凝，血樣于室溫下30 min 內分離，3 000×g離心10 min分離血漿。取血漿105 μL加入2.5 mmol/L乙酰半胱氨酸15 μL和SE液(4.5%NaCl，20 mmol/L EDTA)30 μL，振蕩混勻；加入0.6 mol/L 3-丁基磷15 μL混勻，冰浴反應30 min。加入0.6 mol/L高氯酸150 μL混勻，室溫放置10 min，5 000×g離心5 min。取上清液25 μL加入0.125 mol/L硼酸緩沖液(pH 9.5)62.5 μL、1.55 mol/L 氫氧化鈉5 μL和SBDF 25 μL混勻后，60 ℃孵育60 min，放人冰水中終止反應。反應產物3 000×g離心3 min，取上清液10 μL 進樣作高效液相分析。樣本 Hcy 和內標的保留時間分別為3.056 min和5.763 min，并能與其它峰有效地分開。血漿 Hcy的標準曲線用加入已知量的Hcy到正常血漿中，通過上述反應來測定，由加入的 Hcy 濃度對絕對峰面積作標準曲線，所加入Hcy的變化范圍為0～45 μmol/L，在此變化范圍內，Hcy濃度與絕對峰面積之間具有良好的線性關系(R2=0.9993，Y=0.007819，X=0.0042)。

3.3Bielschowsky銀染[7]大鼠經過灌注、固定后對腦組織進行振蕩切片，厚度為30 μm。切片用PBS洗3×5 min，2%～4%AgNO3，37 ℃避光30 min，ddH2O洗3×5 min，10%甲醛還原5 min至切片微黃，ddH2O洗3×5 min，200 μL/片加入氨銀乙醇液5 min，ddH2O洗3×5 min，常規脫水、透明、封片。

3.4免疫印跡 取同側海馬加入400 μL勻漿液(100 mmol/L Tris-HCl pH 7.4, 300 mmol/L NaCl, 20 mmol/L NaF, 2 mmol/L Na3VO4·12H2O, 1 mmol/L EDTA, 0.5 mmol/L PMSF， 2.0 mg/L 胃蛋白酶抑制劑)進行勻漿、超聲。加入1/3體積的4×上樣緩沖液，煮沸 10 min 使蛋白變性, 4 ℃、12 000 r/ min離心15 min，取上清。BCA法測定樣品的蛋白含量，各泳道的蛋白上樣總量為30 μg。樣品經 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉移至醋酸纖維(NC)膜上，將 NC 膜用5%脫脂奶粉室溫振蕩封閉60 min，加入I抗, 4 ℃孵育過夜，TBS緩沖液 (Tris 50 mmol/L, NaCl 100 mmol/L，pH 7.5) 沖洗3次。加HRP標記的羊抗兔II抗 IgG (1∶5 000)， 37 ℃孵育膜1 h，TBS漂洗10 min×3次。加ECL顯色液顯色后進行曝光、沖洗膠片，掃描分析條帶后保存膠片。

4統計學處理

結 果

1補充葉酸和VitB12可逆轉血漿Hcy水平的升高

使用高效液相色譜法測定各組老年大鼠血漿中Hcy的水平，結果發現，Hcy組血漿內Hcy水平明顯升高，達15.2 μmol/L，較control組 8.6 μmol/L明顯升高，表明高Hcy血癥模型制造成功；與Hcy組相比，Hcy+FB組血漿內Hcy水平明顯降低至12.6 μmol/L，顯著差異(P<0.05),見表1。這個結果表明，葉酸和Vit B12可有效降低血漿內Hcy水平。此外，各組大鼠的體重沒有顯著差異。

表1各組大鼠血漿Hcy和體重的變化

GroupHcy(μmol/L)Weight(g)Control8．6±1．1545±15Hcy15．2±1．2?543±17Hcy+FB12．6±1．1#547±19

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsHcy group.

2血漿高Hcy水平可誘導老年大鼠海馬tau蛋白神經纖維樣纏結

Hcy組在海馬CA3區細胞質染色增加，而在補充葉酸和Vit B12后染色弱于Hcy組，見圖1。我們還檢測了大鼠的腦皮質染色變化，發現染色主要分布在細胞質和突起，在Hcy組胞漿染色更深，更重要的是，該突起是蜿蜒而不是直線，在補充葉酸和Vit B12后細胞質的染色變得非常弱，突起變直。

Figure 1. Bielschowsky silver staining of rat hippocampus and cortex. In the CA3 region of hippocampus, the staining was increased mainly in the cytoplasm after 28-week injection of Hcy, while the staining of the cytoplasm in Hcy+FB group became weaker than that in Hcy group and the neurites was also a little stained. In the cortex of the rat brain, the staining was distributed in the cytoplasm and neurites, but it was more deeply stained in the cytoplasma of Hcy group, and the cytoplasma staining became very weak after FB injection. Scale bar = 100 μm.

圖1Bielschowsky銀染檢測纖維狀纏結結構

3血漿高Hcy水平可誘導老年大鼠海馬tau蛋白過度磷酸化

Hcy 組p-Ser396表達升高，而非磷酸化的 Tau1表達降低；與Hcy組相比，Hcy+FB組p-Ser396蛋白表達水平明顯降低，而Tau1表達水平升高，Tau5(檢測總tau水平)沒有明顯變化，見圖2。這提示高Hcy血癥可誘導tau蛋白在Ser396和Ser199/202位點磷酸化水平明顯增加；補充葉酸和Vit B12可明顯逆轉由高Hcy所誘導的tau蛋白多位點磷酸化水平的升高。

4Hcy對蛋白激酶和磷酸酶活動的影響

Hcy注射后GSK-3β和PP2A-C蛋白水平沒有變化，但GSK-3β在Ser9位點磷酸化(非活性)水平下降，p-PP2A-C-Tyr307(非活性)水平升高，補充葉酸和Vit B12后使上述各指標恢復到正常水平，見圖3。這說明高Hcy水平可使GSK-3β活性升高，PP2A活性降低；而補充葉酸和Vit B12后恢復這些活性的變化。

圖2葉酸和VitB12對Hcy引起的大鼠海馬tau蛋白過度磷酸化的影響

圖3葉酸和VitB12對Hcy引起的tau蛋白上游激酶和磷酸酶的影響

討 論

隨著年齡的增加，血漿Hcy的濃度逐漸增加[8]，高Hcy血癥已被作為阿爾茨海默氏病的一個強大和獨立的危險因素[2]，以上研究結果提示，Hcy血癥和阿爾茨海默病的病變之間可能存在一定聯系。由于阿爾茨海默病是高發于老年人的疾病，所以在本次研究中我們通過構建高Hcy血癥老年大鼠模型，研究高Hcy血癥對大鼠微管相關蛋白 tau的作用及其可能機制。tau蛋白是主要的細胞骨架蛋白之一，能夠調節神經元的結構和功能，包含85個潛在的磷酸化位點[9]，在老年癡呆中，這些位點按一定的順序先后發生磷酸化[10]。作為神經纏結的主要蛋白成分之一，與老年癡呆的遺忘癥狀呈正相關性[11]。高Hcy血癥能誘導老年大鼠tau蛋白在多個老年癡呆樣位點的過度磷酸化。由于tau蛋白磷酸化會增加tau不溶性而使tau蛋白聚積而形成纏結，我們通過Bielschowsky銀染發現了過度磷酸化tau蛋白組成的纏結樣結構。

由于在老年癡呆病癥中，tau蛋白的過度磷酸化是蛋白激酶和磷酸酯酶不平衡表達的結果，因此，我們檢測了參與tau蛋白磷酸化調節的蛋白激酶GSK-3β和磷酸酯酶PP2A。結果發現，PP2A活性降低而GSK-3β活性增加，這說明 PP2A 和 GSK-3β可能參與了高Hcy誘導的tau蛋白過度磷酸化，但詳細機制需要作進一步的研究。

Hcy來自必需氨基酸蛋氨酸，可以再甲基化成蛋氨酸。這種反應是由蛋氨酸合成酶催化，這就要求Vit B12作為輔助因子，甲基四氫葉酸作為輔助碳源。通過補充B族Vit減少血漿Hcy的濃度可能會提供一些針對認知功能減退的保護[12]。本次研究結果證實了這點推測。補充葉酸和Vit B12可以降低血漿中Hcy水平，逆轉由高Hcy所導致的tau蛋白過度磷酸化。

Hcy血癥可能以多種方式促進癡呆癥的發病機制，如通過腦微血管內皮功能障礙，氧化應激，β淀粉樣肽的神經毒性及神經細胞凋亡。Hcy的代謝產物磺基Hcy，也可能通過激活N-甲基-D-天冬氨酸受體造成神經元興奮刺激[13]。是否這些機制在老年大鼠大腦中發揮相同的功能還需要進一步研究。

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ProtectiveeffectoffolateandvitaminB12onAlzheimer-likepathologicalchangesinbrainofagedratswithhyperhomocysteinemia

WEI Wei, LU Da-xiang, QI Ren-bin, WANG Da-an

(DepartmentofPathophysiology,KeyLaboratoryofStateAdministrationofTraditionalChineseMedicine,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou, 510632,China.E-mail:rocky1240@163.com)

AIM: To explore the effect of hyperhomocysteinemia on the Alzheimer-like pathological changes in the brain of aged rat.METHODSThe rats were treated with homocysteine (Hcy) by intravenous injection through vena caudalis with or without a simultaneous supplementation of folate and Vitamin B12(FB) in the drinking water for 28 weeks. The distribution and aggregation of tau protein were detected by Bielschowsky silver staining. Western blotting was used to determine the protein levels of tau phosphorylation, glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β) and protein phosphatase 2A (PP2A).RESULTSTreatment with Hcy induced hyperhomocysteinemia in aged rats and resulted in the formation of neurofibrillary tangles in the brain. Supplementation of FB effectively reduced the tangles. Hyperhomocysteinemia also induced Alzheimer-like tau hyperphosphorylation at multiple sites (Ser199/202and Ser396). Hyperhomocysteinemia activated GSK-3β and inhibited the activity of PP2A. Supplementation of FB alleviated the changes of tau and the activities of GSK-3β and PP2A.CONCLUSIONSupplementation of FB ameliorates the hyperhomocysteinemia-induced Alzheimer-like pathological changes of tau protein possibly through regulating the activity of GSK-3β and PP2A in aged rats.

Aged rat; Tau protein; Folic acid; Vitamin B12; Alzheimer disease

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.08.018