晝夜節(jié)律蛋白Cry2作為結(jié)直腸癌預(yù)后和化療敏感性預(yù)測(cè)因子的研究*

周俊懌， 方樂(lè)堃， 鄧艷紅， 劉煥亮， 王 磊， 汪建平， 黃美近

(中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院，廣東廣州510655)

晝夜節(jié)律(circadian rhythm)是以24 h左右為周期變動(dòng)的生命活動(dòng)，又稱近日節(jié)律［1］。越來(lái)越多的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)晝夜節(jié)律的紊亂與乳腺癌、結(jié)腸癌的發(fā)病相關(guān)［2－5］。動(dòng)物都存在著維持晝夜節(jié)律的系統(tǒng)——晝夜節(jié)律蛋白，目前至少發(fā)現(xiàn)9種晝夜節(jié)律蛋白(Clock、Per1、Per2、Bmal1、Cry1、Cry2、Tim、酪蛋白激酶1和糖原合酶激酶3β)［6－8］。目前對(duì)晝夜節(jié)律及其調(diào)控蛋白研究日益深入，晝夜節(jié)律對(duì)結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后存在影響，但目前尚未有報(bào)道使用晝夜節(jié)律蛋白對(duì)結(jié)直腸癌的預(yù)后進(jìn)行評(píng)估。本文旨在探索用晝夜節(jié)律蛋白Cry2對(duì)結(jié)直腸癌的預(yù)后及新輔助化療敏感性、新輔助化療后的生存期進(jìn)行預(yù)測(cè)。

材料和方法

1 材料與對(duì)象

選16名規(guī)律地接受包含5－氟尿嘧啶的新輔助化療的結(jié)直腸癌切除術(shù)患者。使用結(jié)腸鏡獲取新輔助化療之前的腫瘤標(biāo)本。通過(guò)CT/MRI計(jì)算腫瘤體積的減少率或腫瘤反應(yīng)速度，從而反映化療療效。使用實(shí)體腫瘤療效評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)來(lái)評(píng)估化療療效:完全反應(yīng)(complete response，CR;病灶消失)、部分反應(yīng)(partial response，PR;縮小≥30%)、病灶穩(wěn)定(stable disease，SD;縮小＜30%或增大≤20%)和病灶進(jìn)展(progress disease，PD;增大≥20%)。同時(shí)，我們收集307名在2001年至2005年間接受結(jié)直腸癌切除術(shù)的患者的腫瘤標(biāo)本與隨訪資料，這些患者未接受新輔助治療。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。以總生存為結(jié)束點(diǎn)，生存時(shí)間從手術(shù)當(dāng)天算起，直至死亡或者最后一次隨訪的時(shí)間。

2 主要試劑

免疫組化試劑盒和3，3'－二氨基聯(lián)苯胺(3，3'－diaminobenzidine，DAB;北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);兔單克隆抗體Cry2(Abcam)。

3 方法

3.1 組織芯片(tissue microarray，TMA)制作［9］組織石蠟塊對(duì)照其相應(yīng)的HE染色玻片，確定腫瘤組織位置，為確保組織芯片樣本代表性及防止掉片導(dǎo)致信息丟失，使用組織芯片儀(MiniCore，ALPHELYS)以直徑2 mm在石蠟塊上取出選定組織(每份標(biāo)本取2份組織)。每個(gè)標(biāo)本取2個(gè)點(diǎn)，制成組織芯片蠟塊，每個(gè)芯片蠟塊含12×8個(gè)點(diǎn)。標(biāo)本置于免疫組化專用防脫片載玻片上，制作成組織芯片玻片。

3.2 免疫組織化學(xué) TMA玻片在二甲苯脫蠟，通過(guò)梯度的乙醇重新水化，清水洗凈后，置于枸櫞酸鹽緩沖液(pH=6)中，使用微波加熱3 min修復(fù)抗原。冷卻后，于3%過(guò)氧化氫中浸泡10 min，消耗內(nèi)在的過(guò)氧化物酶，再在室溫下予10%正常山羊血清孵育20 min，封閉非特異性抗原。最后將組織芯片覆蓋上兔單克隆抗體Cry2(Abcam，1∶100稀釋)，置于濕盒中4℃過(guò)夜。接著將芯片置于Ⅰ抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)中室溫孵育1 h，最后滴加DAB。最后，用蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精脫色，并封片。使用普通兔IgG代替Ⅱ抗作為陰性對(duì)照。使用免疫組化檢測(cè)陽(yáng)性的組織作為陽(yáng)性對(duì)照。

3.3 免疫組化檢測(cè)的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 所有標(biāo)本均于100和200倍放大下獲取圖片，并由2名獨(dú)立的病理醫(yī)生單獨(dú)閱片，使用Image－Pro Plus 6.0進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并進(jìn)行半定量評(píng)分(immunoreactivity score，IRS)。陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞比例，1分:＜25%;2分:25%～50%;3分:50%～75%;4分:＞75%。表達(dá)強(qiáng)度，0分:無(wú)表達(dá);1分:弱陽(yáng)性;2分:中等陽(yáng)性;3分:強(qiáng)陽(yáng)性。然后將2個(gè)分?jǐn)?shù)相乘，通過(guò)繪制ROC曲線獲得分界值，IRS 0～4分定義為Cry2低表達(dá)，IRS 5～12分定義為Cry2高表達(dá)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 16.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。ROC曲線分析確定Cry2高、低表達(dá)的分界點(diǎn)。Cry2表達(dá)和結(jié)直腸癌患者的臨床病理特點(diǎn)間的關(guān)系用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析，用log－rank檢驗(yàn)進(jìn)行單因素生存分析，用Cox回歸模型確定獨(dú)立預(yù)后因素，用Kapla－Meier法繪制生存曲線。設(shè)定雙側(cè)P＜0.05為有意義結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示。

結(jié)果

1 Cry2在化療敏感和化療抵抗病例中的差異

16名接受以5－氟尿嘧啶為基礎(chǔ)的新輔助化療的結(jié)直腸癌患者，以化療反應(yīng)分成2組，CR/PR組8名患者，SD/PD組8名，結(jié)果表明，CR/PR組Cry2表達(dá)較低，SD/PD組Cry2表達(dá)較高，見圖1。因?yàn)榭偫龜?shù)為16例，少于40例，用Fisher確切概率檢驗(yàn)進(jìn)行分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1、圖2。

Figure 1.Expession of Cry2 in colorectal cancer tissues from chemotherapy－sensitive(A)and chemotherapy－resistant(B)patients(immunohistochemical staining，×200).圖1 化療敏感和化療抵抗患者結(jié)直腸癌組織Cry2的表達(dá)

表1 新輔助化療患者Cry2的表達(dá)Table 1 .Expression of Cry2 in patients with neoadjuvant chemotherapy(n=8)

Figure 2.Comparison of Cry2 expression between CR/PR and SD/PD groups.CR/PR:complete response/partial response;SD/PD:stable disease/progress disease. s.n=3.＊＊P＜0.01 vs CR/PR group.圖2 CR/PR組和SD/PD組Cry2表達(dá)的比較

2 307例結(jié)直腸癌患者基本資料

收集307名2001年至2005年間接受結(jié)直腸癌切除術(shù)的患者，并按Cry2表達(dá)的強(qiáng)弱分成2組，見表2。這2組在性別、年齡、腫瘤位置、組織分級(jí)、腫瘤分期及采納化療各方面無(wú)顯著差異，具可比性。

3 Cry2表達(dá)高低對(duì)總生存時(shí)間的影響

性別、年齡、組織分級(jí)、病理學(xué)T分期和是否化療對(duì)患者的總生存時(shí)間均無(wú)影響，腫瘤位置、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及Cry2表達(dá)情況對(duì)總生存時(shí)間存在影響。結(jié)腸腫瘤、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、Cry2低表達(dá)預(yù)后較好，見表3、圖3。

4 Cry2表達(dá)是影響預(yù)后的獨(dú)立因素

性別、病理學(xué)T分期、化療與否對(duì)生存的影響并非獨(dú)立的，年齡、腫瘤位置、組織分級(jí)、病理學(xué)N分期、病理學(xué)M分期和Cry2的表達(dá)是影響預(yù)后的獨(dú)立因素，見表4。

5 Cry2表達(dá)是影響化療預(yù)后的獨(dú)立因素

年齡、腫瘤位置、組織分級(jí)、病理學(xué)T分期對(duì)化療影響并非獨(dú)立的。性別、病理學(xué)N分期、病理學(xué)M分期和Cry2的表達(dá)是影響化療預(yù)后的獨(dú)立因素，見表5、圖4。

討論

1 Cry2對(duì)新輔助治療的指導(dǎo)作用

Cry2的表達(dá)與晝夜節(jié)律調(diào)整有關(guān)［10］，而晝夜節(jié)律與腫瘤的發(fā)生有關(guān)［2－5］，結(jié)果顯示SD/PD組Cry2表達(dá)較高，而CR/PR組Cry2表達(dá)較低。這充分說(shuō)明了Cry2高表達(dá)時(shí)化療療效較差，而Cry2低表達(dá)時(shí)化療療效較好。進(jìn)一步可以說(shuō)明，Cry2高表達(dá)時(shí)，患者化療效果差，可不考慮行新輔助化療，Cry2低表達(dá)時(shí)，化療效果好，可考慮行新輔助化療。當(dāng)然我們的研究中，病例數(shù)仍然不足，需繼續(xù)擴(kuò)大病例數(shù)，使結(jié)果更為可信。

表2 2001～2005年結(jié)直腸癌手術(shù)患者Cry2的表達(dá)情況Table 2 .Expression in Cry2 in patients with colorectal cancer excision between 2001 and 2005

Figure 3.The different overall survival time of all the patients with high and low Cry2 expression.圖3 所有病人Cry2表達(dá)高低對(duì)總生存時(shí)間的影響

表3 患者不同預(yù)后參數(shù)的單因素分析Table 3 .Univariate analysis of the average survival time of all the patients

表4 所有患者不同預(yù)后參數(shù)的多因素分析Table 4 .Multivariate analysis of the overall survival time of all the patients(n=307)

表5 患者接受新輔助化療后不同預(yù)后參數(shù)的多因素分析Table 5 .Multivariate analysis of the overall survival time of the patients with neoadjuvant chemotherapy(n=79)

Figure 4.The different overall survival time of the patients who received neoadjuvant chemotherapy between high and low Cry2 expression.圖4 新輔助化療病人Cry2表達(dá)高低對(duì)總生存時(shí)間的影響

2 Cry2預(yù)測(cè)CRC患者總生存的作用

AJCC第6版中，ⅡA和ⅡB期5年生存率分別為71.6%和 66.4%，IIIA、IIIB和 IIIC期分別為46.2%、40.1%和28.3%。2002年，美國(guó)國(guó)家癌癥數(shù)據(jù)中心研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)化III期結(jié)腸癌分期標(biāo)準(zhǔn)可以進(jìn)一步區(qū)分預(yù)后。其中IIIA期(T1～2，N1)5年生存率為59.8%、IIIB期(T3～4，N1)5年生存率為42.0%，IIIC期(任何T，N2)5年生存率為27.3%(P＜0.01)。本研究中，Cry2高表達(dá)的病人總生存時(shí)間比Cry2低表達(dá)的患者總生存時(shí)間短。Cry2表達(dá)的高低與性別、年齡、腫瘤位置、組織學(xué)等級(jí)、病理學(xué)分級(jí)等無(wú)關(guān)，同時(shí)多因素COX回歸分析的結(jié)果顯示，Cry2高表達(dá)可以作為提示結(jié)直腸癌患者預(yù)后差的獨(dú)立因素。這將為評(píng)估患者預(yù)后帶來(lái)巨大的方便，僅僅通過(guò)免疫組化的方法，就可以對(duì)結(jié)直腸癌患者預(yù)后進(jìn)行評(píng)估，但是目前我們的樣本量仍然有限，在下一步研究中，應(yīng)繼續(xù)擴(kuò)大樣本量，并進(jìn)行多中心研究，明確Cry2作為預(yù)后因子的作用。在單因素分析中，其它提示總生存率低的因素分別是腫瘤位置(P＜0.01)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P＜0.05)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P＜0.01)。

3 Cry2預(yù)測(cè)新輔助化療效果的作用

文獻(xiàn)報(bào)道晝夜節(jié)律對(duì)化療療效有相當(dāng)顯著的影響［11－20］。在我們的實(shí)驗(yàn)中，我們分析了結(jié)直腸癌患者的Cry2表達(dá)和新輔助化療治療結(jié)果之間關(guān)系(表5、圖5)。新輔助化療以5－氟尿嘧啶為基礎(chǔ)，加或不加亞葉酸鈣或草酸鉑。Kaplan－Meier分析顯示，Cry2高表達(dá)的患者化療后總生存時(shí)間仍比對(duì)照組短(P＜0.05)，與所有病人(化療和不化療的病人)的總生存情況類似，這說(shuō)明化療并不能使Cry2表達(dá)高的患者生存期延長(zhǎng)至與Cry2表達(dá)低的患者相同，提示Cry2可以作為化療的預(yù)測(cè)分子標(biāo)志物。多因素Cox回歸分析顯示，Cry2高表達(dá)預(yù)示著更差的預(yù)后，所以Cry2可以作為一個(gè)獨(dú)立的因子，預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌患者新輔助化療后的預(yù)后情況。

［1］ Bass J.Physiology:on time metabolism［J］.Nature，2011，480(7378):466－467.

［2］ Chen－Goodspeed M，Lee CC.Tumor suppression and circadian function［J］.J Biol Rhythms，2007，22(4): 291－298.

［3］ Stevens RG.Circadian disruption and breast cancer:from melatonin to clock genes［J］.Epidemiology，2005，16 (2):245－258.

［4］ Hansen J，Stevens RG.Case－control study of shift－work and breast cancer risk in Danish nurses:impact of shift systems［J］.Eur J Cancer，2012，48(11):1722－1729.

［5］ Schernhammer ES，Laden F，Speizer FE，et al.Rotating night shifts and risk of breast cancer in women participating in the nurses’health study［J］.J Natl Cancer Inst，2001，93(20):1563－1568.

［6］ Badiu C.Genetic clock of biologic rhythms［J］.J Cell Mol Med，2003，7(4):408－416.

［7］ Ko CH，Takahashi JS.Molecular components of the mammalian circadian clock［J］.Hum Mol Genet，2006，15 (Suppl 2):R271－R277.

［8］ Barnes JW，Tischkau SA，Barnes JA，et al.Requirement of mammalian timeless for circadian rhythmicity［J］.Science，2003，302(5644):439－442.

［9］ 蔣 李，王 磊，黃美近，等.TPI－2表達(dá)與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系與意義［J］.中國(guó)病理生理雜志，2011，27 (7):1403－1405，1413.

［10］ Gauger MA，Sancar A.Cryptochrome，circadian cycle，cell cycle checkpoints，and cancer［J］.Cancer Res，2005，65(15):6828－6834.

［11］ Giacchetti S，Itzhaki M，Gruia G，et al.Long－term survival of patients with unresectable colorectal cancer liver metastases following infusional chemotherapy with 5－fluorouracil，leucovorin，oxaliplatin and surgery［J］.Ann Oncol，1999，10(6):663－669.

［12］ Adam R，Avisar E，Ariche A，et al.Five－year survival following hepatic resection after neoadjuvant therapy for nonresectable colorectal liver metastases［J］.Ann Surg Oncol，2001，8(4):347－353.

［13］ Lévi F，Zidani R，Misset JL.Randomized multicentre trial of chemotherapy with oxaliplatin，fluorouracil，and folinic acid in metastatic colorectal cancer［J］.Lancet，1997，350(9079):681－686.

［14］ Halberg F，Haus E，Cardoso SS，et al.Toward a chronotherapy of neoplasia:tolerance of treatment depends upon host rhythms［J］.Experientia，1973，29(8):909－934.

［15］ Levi FA，Hrushesky WJ，Blomquist CH，et al.Reduction of cis－diamminedichloroplatinum nephrotoxicity in rats by optimal circadian drug timing［J］.Cancer Res，1982，42 (3):950－955.

［16］ Levi F.Chronopharmacology of anticancer agents［M］.∥Redfern PH，Lemmer B.Physiology and pharmacology of biological rhythms.1st ed.Berlin:Springer，1997:299－331.

［17］ Levi F.From circadian rhythms to cancer chronotherapeutics［J］.Chronother Int，2002，19(1):1－19.

［18］ Eriguchi M，F(xiàn)ujii Y，Takeda Y，et al.Chronotherapy: application to chemotherapy for gastric cancer and colorectal cancer［J］.Oncologia，1992，25(35):118－120.

［19］ Eriguchi M，Osada I，F(xiàn)ujii Y，et al.Pilot study for preoperative administration of 1－OHP to patients with advanced scirrhous type gastric cancer［J］.Biomed Pharmacother，1997，51(5):217－220.

［20］ Eriguchi M，Nonaka Y，Yanagie H，et al.A molecular biological study of anti－tumor mechanisms of an anticancer agent Oxaliplatin against established human gastric cancer cell lines［J］.Biomed Pharmacother，2003，57 (9):412－415.