細胞外低滲誘導大鼠胚胎心肌細胞H9c2容積激活性氯電流和調節性細胞容積回縮*

劉振鋒， 厲冰雪， 滕雙鳳， 羅 海， 林 娜， 黃維淵， 朱林燕， 王立偉△， 陳麗新△

(暨南大學醫學院1生理學系，2藥理學系，廣東廣州510632)

容積激活性氯通道廣泛存在于哺乳動物細胞上，參與細胞的多種生理和病理過程的調節。我們前期在鼻咽癌以及白血病細胞的研究中發現，容積敏感性氯通道在細胞的調節性容積回縮(regulatory volume decrease，RVD)過程中起重要作用，并參與了細胞的增殖、遷移、凋亡等過程［1－4］。近年來研究顯示，容積激活性氯通道和許多心血管疾病的發生發展密切相關，其在心肌缺血、心肌肥大、心臟衰竭以及高血壓引起的血管重塑過程中起重要作用［5］。大鼠胚胎心肌細胞H9c2細胞株是研究心肌細胞功能活動的常用細胞株，為心臟的生理病理研究提供了便利，以往有學者用之探討心肌細胞鉀離子通道和鈣離子通道的功能活動［6－7］，但目前未見該細胞株是否存在容積激活性氯通道的報道。本研究探討細胞外低滲刺激是否可以誘導H9c2細胞容積激活性氯電流，研究該細胞的調節性容積回縮過程，這有助于闡明心肌細胞容積激活性氯通道的功能和調節性容積回縮能力，為了解容積激活性氯通道在心臟疾病的發生與發展中所起的作用奠定實驗基礎。

材料和方法

1 細胞培養

大鼠胚胎心肌細胞H9c2細胞株用含10%FBS、1×105U/L青霉素和 100 mg/L鏈霉素的高糖DMEM生長液(Gibco)常規培養在37℃、飽和濕度、5%CO2培養箱內，每2 d傳代1次。

2 主要試劑

氯通道阻斷劑他莫昔芬(tamoxifen)、5－硝基－2－(3－苯丙胺)苯甲酸［5－nitro－2－(3－phenylpropylamino)benzoic acid，NPPB］和ATP均購自Sigma。Tamoxifen在實驗當天用甲醇新鮮配成 40 mmol/L母液，使用時用相應的灌流液稀釋至終濃度20 μmol/L。NPPB用DMSO配成100 mmol/L儲存液，儲存在4℃冰箱中，使用時用相應的灌流液稀釋至終濃度 100 μmol/L。ATP用蒸餾水配成 100 mmol/L儲存液，儲存在－20℃中，實驗終濃度為10 mmol/L。

3 灌流液與電極內液

等滲灌流液(isotonic solution，ISO)滲透壓為300 mOsmol/L，含(mmol/L):70 NaCl、0.5 MgCl2、2 CaCl2、10 HEPES和140 D－mannitol。低滲液(hypotonic solution，HYPO)滲透壓為160 mOsmol/L，除不含甘露醇外，其它成分和濃度與等滲灌流液相同。高滲液(hypertonic solution，HYPER)滲透壓為440 mOsmol/L，含280 D－mannitol，其余成分與等滲灌流液相同。各灌流液分別用Tris液調pH至7.4。灌流液配制畢后，用冰點滲透壓計(Osmomat 030; Gonotec，Germany)檢測溶液滲透壓。

電極內液組成(mmol/L):70 N－methyl－D－glucamine chloride(NMDG －Cl)，1.2 MgCl2，10 HEPES，1 EGTA，140 D－mannitol和2 ATP，用鹽酸調節pH值至7.25。微電極充灌電極內液后尖端電阻為(5～10)MΩ。

4 全細胞膜片鉗

用EPC－7膜片鉗放大器(List Electronic，Germany)記錄H9c2細胞的全細胞電流。電流和電壓信號用CED1401(Cambrige，UK)數字化(采樣頻率3 kHz)，實驗數據用EPC(CED，Cambridge，UK)軟件分析。

H9c2細胞用0.125%胰酶消化后制成細胞懸液，并滴于玻片上，待細胞貼壁牢固后進行實驗。電壓鉗制模式有2種:(1)細胞被鉗制在0、－40、+40、－80、+80 mV，并不斷反復循環，每個鉗制脈沖波寬200 ms，間隔4 s，在每個鉗制脈沖開始10 ms后取值;(2)鉗制電壓－120 mV～120 mV，步增20 mV，每個鉗制脈沖波寬300 ms，間隔1 s，在每個鉗制脈沖開始10 ms后取值。在每個脈沖開始。先用等滲液灌流細胞5 min，記錄此時背景電流，再用低滲液給予細胞刺激，同時記錄電流。在電流增大至穩定后，改換含不同氯通道阻斷劑的低滲液繼續灌流，待電流被抑制平穩時計算電流的抑制率。

阻斷劑對電流抑制率的計算公式為:

抑制率(%) = ［(IHYPO－IISO) － (IBLOCKERSIISO)］/(IHYPO－IISO)×100%。其中IHYPO是47%HYPO作用到穩定時電流;IISO是等滲灌流時電流;IBLOCKERS是47%HYPO加入阻斷劑至作用穩定時電流。

5 細胞體積測量

將細胞消化后制成懸液滴于玻片上，貼壁牢固后置于顯微鏡下拍圖。實驗分為低滲組和NPPB組，低滲組先將細胞用等滲灌流液灌流10 min，然后更換低滲液繼續灌流;NPPB組先將細胞用等滲灌流液適應5 min，加入含100 μmol/L NPPB繼續灌流5 min，然后更換為含等濃度NPPB的低滲液灌流35 min，全程灌流45 min。

實驗完成后用圖像分析軟件(Image－Pro Plus 6.3)測量細胞的面積，從而間接測量細胞的直徑，再轉換成細胞容積V后，對細胞容積進行標準化處理。取細胞灌流1～5 min的體積均值作為初始體積V0。

細胞容積V、標準化體積Vst和細胞RVD能力的計算公式分別為:

其中，Vmax為細胞最大時的標準化體積，Vend為細胞在第45 min的標準化體積。

6 統計學處理

采用SPSS 13.0進行統計分析，數據用均數±標準誤(±sE)表示，用方差分析(ANOVA)檢驗均數差異顯著性，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 細胞外低滲誘導大鼠胚胎心肌細胞H9c2容積激活性氯電流

采用全細胞記錄模式記錄H9c2細胞的跨膜電流。等滲條件下，可以記錄到一基礎電流，該基礎電流微小且穩定。在+80 mV和－80 mV電壓鉗制下，其平均電流密度分別為(5.30±0.80)pA/pF和 (－4.82±0.85)pA/pF(n=30)。當將等滲液換為低滲液進行細胞灌流時，跨膜電流迅速增大，最后穩定在峰值。平均電流密度分別為(47.77±3.80) pA/pF和(－33.36±2.80)pA/pF(n=30，P＜0.01)，內向電流較外向電流為小，表現出外向優勢。其翻轉電位是(－9.02±0.61)mV，見圖1A、B。

在鉗制電壓為±120 mV，電壓間距20 mV，鉗制脈沖波寬為300 ms時，電流并沒有表現出明顯的時間依賴性失活和電壓依賴性失活，見圖1C。

2 低滲誘導H9c2細胞氯電流的容積敏感性

在低滲誘發的電流達到峰值并平穩后，換用47%高滲液灌流，電流明顯減小。高滲液對外、內向電流的抑制率分別為:(100.17±1.34)%和(98.44 ±1.74)%(n=9，P＜0.01)。這說明該電流是具有容積敏感性的，其可被低滲灌流液誘導產生，又可被高滲灌流液抑制，見圖2。圖2A為低滲灌流誘導容積激活性電流的全程圖，圖2B為細胞平均電流密度與鉗制電壓之間的關系，圖2C、D分別為該電流在低滲及高滲灌流液作用下的瞬時電流圖。

Figure 1.Chloride currents activated by hypotonicity in H9c2 cells.A:typical time course of the current activated by hypotonicity.B: current－voltage relationship.±sE.n=30.＊＊P＜0.01 vs ISO.ISO:isotonic control solution;HYPO:hypotonic bath solution.C:typical current traces recorded in hypotonic solution.圖1 低滲激活的H9c2全細胞氯電流

Figure 2.Inhibition of hypotonicity－activated chloride currents by hypertonic bath solution in H9c2 cells.A:typical time course of the chloride currents induced by hypotonicity and inhibition of the currents by cell shrinkage induced by the hypertonicity.B:current－voltage relationship.±sE.n=9.＊＊P＜0.01 vs HYPO.C:typical current traces recorded in hypotonic solution.D:typical current traces recorded in hypertonic solution.圖2 高滲液抑制低滲激活的氯電流

3 氯通道阻斷劑抑制低滲激活的氯電流

為了進一步分析氯通道在低滲刺激誘導的H9c2細胞電流中的作用，我們觀察了氯通道阻斷劑對低滲激活的H9c2細胞氯電流的影響，發現該電流均可以被tamoxifen、NPPB和ATP這3種氯通道阻斷劑不同程度抑制。

在+80 mV和－80 mV鉗制電壓時，tamoxifen抑制低滲液激活的氯電流，其對外內向電流的抑制率分別為:(73.96±6.70)%和(76.51±4.64)%(n= 7，P＜0.01)。圖3A、B、C、D分別為tamoxifen抑制低滲激活的氯電流全程圖、電流密度－電壓關系、低滲及tamoxifen作用下的瞬時電流圖。

Figure 3.Inhibition of hypotonicity－activated chloride currents by chloride channel blocker tamoxifen in H9c2 cells.A:typical time course of the chloride current induced by hypotonicity and inhibition of the currents by tamoxifen(20 μmol/L).B:current－voltage relationship.±sE.n=7.＊＊P＜0.01 vs HYPO.C:typical current traces recorded in hypotonic solution.D: typical current traces recorded in hypotonic solution containing tamoxifen.圖3 氯通道阻斷劑tamoxifen抑制低滲激活的氯電流

NPPB可以抑制該容積敏感性電流，見圖4。其對外內向電流的抑制率分別為:(81.12±6.11)%和(79.06±7.64)%(n=5，P＜0.01)。圖4A、B、C、D分別為NPPB抑制低滲激活的氯電流全程圖、電流密度－電壓關系、低滲及NPPB作用下的瞬時電流圖。

Figure 4.Inhibition of hypotonicity－activated chloride currents by chloride channel blocker NPPB in H9c2 cells.A:typical time course of the chloride currents induced by hypotonicity and inhibition of the currents by NPPB(100 μmol/L).B:currentvoltage relationship.±sE.n=5.＊＊P＜0.01 vs HYPO.C:typical current traces recorded in hypotonic solution.D:typical current traces recorded in hypotonic solution containing NPPB.圖4 氯通道阻斷劑NPPB抑制低滲激活的氯電流

ATP顯著抑制該容積敏感性電流，見圖5。其對外、內向電流的抑制率分別為:(91.94±2.78)%和(40.01±8.80)%(n=6，P＜0.01)，其對外向電流的抑制作用遠遠大于對內向電流的抑制作用。圖5A、B、C、D分別為ATP抑制低滲激活的氯電流全程圖、電流密度－電壓曲線、低滲及ATP作用下的瞬時電流圖。

NPPB和tamoxifen灌流液中分別含有相應濃度的DMSO和甲醇，為排除兩者的影響，用0.1%DMSO及0.05%甲醇的47%低滲灌流液分別作用于H9c2細胞，發現電流無明顯改變。

4 低滲誘導心肌細胞調節性容積回縮及氯通道阻斷劑對心肌細胞調節性容積回縮的影響

低滲液在H9c2細胞中誘發明顯的RVD。在等滲液灌流下，細胞容積穩定，當灌流液從等滲液換為低滲液時，細胞迅速增大，在低滲液作用于細胞5 min時達到最大，此時細胞容積增加至(147.82±4.57)%(n =8)，隨后容積逐漸減小，低滲35 min時細胞容積減少為(115.55±3.86)%(n=8，P＜0.01)。RVD使細胞容積回復(69.73±8.83)%，見圖6A、C。

細胞在含NPPB的等滲灌流液中輕微脹大。更換含NPPB的低滲液(HYPO+NPPB)繼續灌流，觀察到細胞迅速脹大，HYPO+NPPB作用5 min時細胞容積為(142.82±4.03)%，與低滲組細胞容積的最大值(147.82±4.57)%比較，差異沒有統計學意義。隨后細胞體積較穩定，未見明顯細胞容積回縮。HYPO+NPPB作用35 min時，細胞體積為(149.19±9.06)%(n=8)，與低滲組比較，兩者在45 min時的體積差別有統計學意義(P＜0.01)，見圖6B、C。

Figure 6.Chloride channel blocker NPPB inhibited the RVD process in H9c2 cells.ISO:isotonic bath solution;HYPO:hypotonic bath solution;HYPO+NPPB:hypotonic bath solution containing 100 μmol/L NPPB.A:cell images taken in the isotonic solution(ISO)and 47%hypotonic solution for 5 min(HYPO 5 min)and 30 min(HYPO 30 min);B:cell images taken in the isotonic solution containing NPPB(ISO+NPPB)and 47%hypotonic solution containing NPPB for 5 min(HYPO+ NPPB 5 min)and 30 min(HYPO+NPPB 30 min);C:inhibition of RVD by chloride channel blocker NPPB in H9c2 cells.±sE.n=8.＊＊P＜0.01 vs HYPO.圖6 氯通道阻斷劑NPPB抑制H9c2心肌細胞的調節性容積回縮過程

討論

細胞容積維持相對穩定是細胞進行正常生理活動的必要條件。心肌細胞需有一定的容積調節能力，使其在遭受內外滲透壓變化時仍能維持自身容積的相對穩定，氯通道在這一生理調節過程中起著重要作用。不僅如此，在某些病理條件下，如心肌缺血、心力衰竭、心律失常等可以記錄到激活的容積激活性氯電流，這說明，其在心臟的病理過程中也具有重要意義［8］。心肌缺血時，心肌細胞內線粒體氧化磷酸化途徑受抑，ATP生成減少，鈉離子、水以及代謝產物在細胞內堆積，造成細胞內高滲，引起心肌細胞水腫，激活容積激活性氯通道從而產生RVD，可能對心肌細胞起保護作用。文獻提示，缺血前處理可以增強心肌細胞的RVD能力［9］，缺血預適應可以增加心臟組織對缺血缺氧的耐受性，對心肌細胞起保護作用。預處理心肌由于缺血缺氧，心肌細胞發生腫脹，可以激活心肌細胞上的容積激活性氯通道，保護缺血再灌注過程中的心肌細胞，使得心臟組織在再次缺氧缺血時避免容積的過度增大［10］。因此，容積激活性氯通道在心肌缺血時發揮重要作用，其可能成為心肌缺氧缺血治療藥物的一個新靶標。在肥大心肌也觀察到容積激活性氯電流的激活［5］，這提示，容積激活性氯通道不僅可能參與了心臟的急性損傷過程，其也可能參與了某些心臟慢性疾患的發生發展。

本研究中，我們使用H9c2細胞作為研究對象，觀察細胞在低滲刺激誘導的容積激活性氯電流特性和調節性容積回縮。結果表明，灌流低滲液后可觀察到H9c2細胞容積迅速脹大，并激活一個具有外向優勢的跨膜電流，由于灌流液與電極內液配方不含鉀離子，且由Nernst公式計算出的鈉離子和鈣離子的平衡電位均大于200 mV，因此可以基本排除電流與這 3種離子的關系。該電流可被 tamoxifen、NPPB、ATP等多種氯通道阻斷劑抑制，這提示低滲在H9c2細胞上激活的電流為氯電流。且計算出的平衡電位較接近氯離子的平衡電位，高滲灌流液可以抑制這個電流，表明該電流有容積敏感性。該電流不表現出明顯的時間依從性失活與電壓依賴性失活，該電流的電生理學特性和藥理學特性與我們前已報道的白血病細胞及低分化鼻咽癌細胞容積激活性氯電流的特性相似［11－12］。H9c2細胞在低滲環境中發生脹大，激活容積激活性氯通道，氯離子外流，伴隨水外流，導致細胞容積減小，即產生調節性容積回縮。用氯通道阻斷劑NPPB抑制H9c2細胞容積激活性氯電流的同時也抑制了該細胞RVD過程，表明低滲刺激可以在H9c2細胞上誘發RVD，容積激活性氯通道在這一過程中起關鍵作用。

我們前期研究顯示，許多抗腫瘤藥物作用于細胞引起細胞凋亡時，能激活氯電流，該電流生理特性與容積激活性氯電流相似，也可以被高滲灌流液完全抑制，具有容積敏感性［13－14］。氯通道阻斷劑能拮抗抗癌藥引起的細胞凋亡，提示氯通道參與抗腫瘤藥誘導的細胞凋亡過程［4］。抗腫瘤藥是否可通過作用于容積敏感性氯通道誘導心肌細胞凋亡而產生心臟毒性，仍需進一步的深入研究。研究H9c2心肌細胞的容積敏感性氯通道的特性，有助于闡明氯通道在心肌生理及病理功能活動中的作用。

［1］ Yang L，Ye D，Ye W，et al.ClC－3 is a main component of background chloride channels activated under isotonic conditions by autocrine ATP in nasopharyngeal carcinoma cells［J］.J Cell Physiol，2011，226(10):2516－2526.

［2］ Chen LX，Zhu LY，Jacob TJ，et al.Roles of volume－activated Cl－currents and regulatory volume decrease in the cell cycle and proliferation in nasopharyngeal carcinoma cells［J］.Cell Prolif，2007，40(2):253－267.

［3］ Mao J，Chen L，Xu B，et al.Volume－activated chloride channels contribute to cell－cycle－dependent regulation of HeLa cell migration［J］.Biochem Pharmacol，2009，77 (2):159－168.

［4］ Zuo W，Zhu L，Bai Z，et al.Chloride channels involve in hydrogen peroxide－induced apoptosis of PC12 cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2009，387(4):666－670.

［5］ Duan DD.The ClC－3 chloride channels in cardiovascular disease［J］.Acta Pharmacol Sin，2011，32(6):675－684.

［6］ Sipido KR，Marban E.L－type calcium channels，potassium channels，and novel nonspecific cation channels in a clonal muscle cell line derived from embryonic rat ventricle［J］.Circ Res，1991，69(6):1487－1499.

［7］ Shi H，Wang H，Han H，et al.Ultrarapid delayed rectifier K(+)current in H9c2 rat ventricular cell line:biophysical property and molecular identity［J］.Cell Physiol Biochem，2002，12(4):215－226.

［8］ Baumgarten CM，Clemo HF.Swelling－activated chloride channels in cardiac physiology and pathophysiology［J］.Prog Biophys Mol Biol，2003，82(1－3):25－42.

［9］ Diaz RJ，Armstrong SC，Batthish M，et al.Enhanced cell volume regulation:a key protective mechanism of ischemic preconditioning in rabbit ventricular myocytes［J］.J Mol Cell Cardiol，2003，35(1):45－58.

［10］ Bozeat ND，Xiang SY，Ye LL，et al.Activation of volume regulated chloride channels protects myocardium from ischemia/reperfusion damage in second－window ischemic preconditioning［J］.Cell Physiol Biochem，2011，28 (6):1265－1278.

［11］ 曹國振，左婉紅，馬文波，等.人急性淋巴細胞白血病細胞容積激活性氯電流的研究［J］.中國病理生理雜志，2011，27(4):677－681.

［12］ 朱林燕，左婉紅，張海峰，等.低滲誘導高分化鼻咽癌細胞CNE－1容積激活性氯電流［J］.中國病理生理雜志，2009，25(6):1094－1097.

［13］ 劉善文，李 媛，李華榮，等.小檗堿激活人結腸癌細胞容積敏感的氯通道［J］.生理學報，2011，63(6): 517－524.

［14］ 羅海兵，李華榮，劉善文，等.蟾蜍靈激活低分化鼻咽癌細胞氯通道［J］.中國病理生理雜志，2011，27(4): 672－676.