缺氧易化快速起搏引起的心室肌細胞鈣瞬變交替*

趙 斌， 王禮春， 莊曉東， 董小變， 黃澤娜， 鄺素娟， 劉曉穎， 廖新學△

(1中山大學附屬第一醫院心血管內科，高血壓血管病科，2廣東省人民醫院醫學研究中心，廣東廣州510080)

盡管惡性心律失常是大多數心臟病患者的重要死因，但是誘導其發作的離子機制尚未完全闡明。心臟交替在臨床上常表現為交替脈，是由于心臟收縮強弱交替出現而引起的［1－2］，它是預測惡性心律失常及評估患者猝死風險的有效指標［3］。最近，在細胞電生理方面的研究結果提示，心臟收縮的這種強弱交替現象與單個心肌細胞的鈣瞬變交替密切相關［4］。心肌細胞鈣瞬變交替是指高頻刺激、心肌缺血、糖代謝障礙以及酸中毒等病理狀態下出現的細胞膜去極化，L型鈣通道開放以及Ca2+內流增加，進而觸發肌漿網大量釋放Ca2+，從而形成了鈣瞬變幅度在心肌細胞的每次搏動之間的交替變化［5－7］。因而，深入研究鈣瞬變交替在心肌缺血誘導的惡性心律失常和心肌功能受損中的作用具有重要的現實意義和臨床價值［8－10］。為此，我們分離成年SD大鼠的心室肌細胞，觀察缺氧處理對心室肌細胞內鈣瞬變交替的影響，并進一步檢測鈣瞬變交替在缺氧損傷心室肌細胞中的作用。

材料和方法

1 材料和試劑

II型膠原酶、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、HEPES和Joklik－modified MEM無鈣培養基(無鈣培養基)購自Sigma－Aldrich，Fluo－4/ AM購自Invitrogen，2－(2－甲氧基－4－硝苯基)－3－(4－硝苯基)－5－(2，4－二磺基苯)－2H－四唑單鈉鹽［2－(2－methoxy－4－nitrophenyl)－3－(4－nitrophenyl)－5－(2，4－disulfophenyl)－2H－tetrazolium，monosodium salt，WST－8］線粒體功能檢測試劑盒購自日本同仁化學研究所。其它試劑均為國產分析純。

2 SD大鼠單個心室肌細胞的分離與缺氧處理

取雄性、3月齡SD大鼠，體重約250 g。通過吸入高濃度的CO2使其麻醉，快速將心臟組織完整地取出，浸泡于0℃無鈣培養基中。保留左冠狀動脈，將其殘端懸掛于Langendorff灌流系統中，逆行灌流。用37℃ 無鈣培養基灌注3 min，以去除組織內殘存的血液，接著用含有Ⅱ型膠原酶0.5g/L、BSA 1g/L和HEPES 10 mmol/L(pH 7.2)的無鈣培養基，37℃灌流40 min。待心室肌組織變軟，用眼科剪剪下心室組織，在15 mL離心管內用無鈣培養基反復吹打，去除殘留的組織塊。靜置10 min后，丟棄上清液，純化心室肌細胞。活力正常的心室肌細胞常呈棒狀，其數目約占總細胞數目的70%。將分離的心室肌細胞儲存于37℃的無鈣培養基中，備用。

心室肌細胞經缺氧處理2 h，同時設置含鈣的Joklik－modified MEM培養基作為對照。缺氧液的成分為(mmol/L):NaCl 135、KCl 3.6、KH2PO41.2、MgSO41.2、HEPES 10和CaCl21.8，并將pH調節至6.5。臨用前通入N2，以排除溶解的O2。

3 心室肌細胞的復鈣和鈣熒光負載處理

將分離的心室肌細胞逐漸梯度復鈣，保持細胞外液中的Ca2+濃度在1.3 mmol/L左右。采用熒光探針Fluo－4/AM檢測細胞內的Ca2+含量。在負載細胞時，取復鈣好的細胞懸液2 mL，加入10 mol/L Fluo－4/AM，37℃避光孵育20 min，使其在細胞內充分水解，然后用含1.25 mmol/L Ca2+的 Joklikmodified MEM培養基洗滌3次，重懸后備用。分離的心室肌細胞要求在分離后8 h內使用。

4 心室肌細胞內鈣瞬變的檢測

按照本實驗室建立的方法［12］，用激光掃描共聚焦顯微鏡(Leica;型號:SP5)檢測心室肌細胞內的鈣瞬變(入射波長為488 nm，發射波長為525 nm)。將備好的心室肌細胞放到載物臺上的灌流槽中，室溫26℃的條件下，以含1.25 mmol/L Ca2+的 Joklikmodified MEM培養基緩慢持續灌流，保持流速在0.2 mL/min。將顯微鏡的視野限制在單個心室肌細胞上，先用平面掃描(xyt)的方式沿著細胞的長軸定下掃描線的具體位置，盡量避開細胞核，再用線掃描(xt pinhole 90 NA)的方式實時記錄電壓刺激(閾上刺激，平均強度為10 V，脈寬1 ms)時細胞內Ca2+的熒光強度與時間的關系，即鈣瞬變。鈣瞬變交替是指鈣瞬變幅度大小交替出現，并相差達10%以上。電刺激頻率按60、120、180、240和300 min－1逐漸遞增，將出現鈣瞬變交替的最低刺激頻率定義為鈣瞬變交替的閾頻率。在200～300 min－1的范圍內，以 2 min－1的幅度遞增，進一步在不同的心室肌細胞檢測出閾刺激。用激光共聚焦顯微鏡系統采集信號，信號強度以平均熒光強度(mean fluorescence intensity，MFI)表示，數據用該系統自帶軟件進行分析。

5 心室肌細胞線粒體脫氫酶活性的檢測

線粒體脫氫酶活性是反映線粒體功能的重要指標，其可代謝WST－8生成黃色的物質。通過檢測黃色物質的深淺可以間接反映線粒體的功能狀態。將分離的心室肌細胞接種于多聚賴氨酸包被的96孔培養板中，細胞貼壁后，分別給予含鈣的Joklikmodified MEM培養基、缺氧液、缺氧液+L－型鈣通道阻滯劑以及單獨L－型鈣通道阻滯劑處理4 h。處理結束后，每孔加1∶10稀釋的 WST－8溶液100 μL，輕搖，37°C孵育3 h，用酶標儀(λ=450 nm)記錄各孔的吸光度(A)。將對照組心室肌細胞的線粒體脫氫酶活性設為100%。

6 統計學處理

結果

1 高頻起搏誘導心室肌細胞出現鈣瞬變交替

心室肌細胞被施予60～240 min－1起搏刺激時，細胞內Ca2+含量的熒光信號隨刺激而出現變化，表現為鈣瞬變現象(圖1A、B和C)。當起搏刺激的頻率進一步增加到300 min－1時，細胞內Ca2+含量的熒光信號除有鈣瞬變現象以外，還表現出強弱交替的變化(圖1D)，即高頻起搏刺激誘導心室肌細胞出現鈣瞬變交替現象。

Figure 1.Effects of different frequencies of pacing stimuli on calcium transient in ventricular myocytes.A:60 min－1;B:180 min－1; C:240 min－1;D:300 min－1.MFI:mean fluorescence intensity.圖1 不同頻率的起搏刺激對心室肌細胞鈣瞬變的影響

2 缺氧處理易化高頻起搏刺激誘導的心室肌細胞鈣瞬變交替

對正常培養的心肌細胞施予240 min－1的起搏刺激時，細胞內Ca2+含量的熒光信號隨刺激規則性出現，無交替現象(圖2A)。經缺氧處理0.25 h后，240 min－1的起搏刺激可使鈣瞬變現象強弱交替出現(圖2B)。此結果提示，在缺氧情況下，刺激更易誘發鈣瞬變交替。進一步給心室肌細胞施予起搏頻率遞增2 min－1的刺激，結果顯示，缺氧組的心室肌細胞出現鈣瞬變交替的閾刺激頻率顯著低于正常對照組的心室肌細胞出現鈣瞬變交替的閾刺激頻率(P＜0.05)，見圖2C。

Figure 2.Effect of hypoxia on calcium transient alternations induced by rapid pacing in ventricular myocytes.Normal ventricular myocytes(A)and hypoxia－stimulated ventricular myocytes(B)were paced at a frequency of 240 min－1and calcium transient was detected.C:normal ventricular myocytes and hypoxia－stimulated ventricular myocytes were paced with increasing frequencies from 200 min－1to 300 min－1and the threshold was measured.±s.n=6.*P＜0.05 vs control.圖2 缺氧處理對快速起搏誘導心室肌細胞鈣瞬變交替的影響

3 輕度缺氧不改變心室肌細胞的顯微結構

為了進一步明確在缺氧誘導心室肌細胞鈣瞬變交替過程中是否存在細胞顯微結構的異常，本研究觀察了心室肌細胞的顯微結構變化。正常心室肌細胞呈棒狀，可見明顯的橫紋及橫小管結構(圖3A)，而經缺氧處理2.5 h后，雖然此時高頻起搏已經能誘導鈣瞬變交替現象，但是心室肌細胞的顯微結構并無明顯的改變，即細胞仍呈棒狀、細胞膜依然完整、橫紋和橫小管結構依然規則(圖3B)。

Figure 3.Effect of hypoxia on ultrastructure of ventricular myocytes.A:control group;B:hypoxia group.圖3 缺氧處理對心室肌細胞顯微結構的影響

4 持續的鈣瞬變交替誘導線粒體功能受損

心室肌細胞經缺氧處理5 h后，線粒體的功能明顯降低，表現為線粒體脫氫酶的相對活性減弱。應用維拉帕米(verapamil，VP)抑制L－型鈣通道，結果顯示，2.5 μmol/L VP在不影響線粒體功能的條件下，可明顯對抗缺氧誘導的線粒體功能受損，使線粒體脫氫酶的相對活性部分恢復，見圖4。

討論

鈣瞬變交替的現象最早是由 Lee等［11］在無意中將灌注心臟的灌流液關閉后發現的。近年來的研究表明，鈣瞬變交替可發生于心肌細胞的高頻起搏刺激、缺血/缺氧損傷以及酸中毒等病理生理條件下［8］。心室肌細胞的鈣瞬變交替是交替脈的電生理基礎，是惡性心律失常的重要預測指標。因而，深入闡明心肌缺血對快速起搏誘導的鈣瞬變交替的影響，對于惡性心律失常的防治具有重要的臨床意義。

Figure 4.Effect of L－type Ca2+channel blocker on the decreased activity of mitochondrial dehydrogenase induced by hypoxia in ventricular myocytes.The ventricular myocytes suffered from hypoxia in the presence or absence of 2.5 μmol/L verapmil(VP)for 5 h，and then the relative activity of mitochondrial dehydrogenase was measured.±s.n=4.＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 vs hypoxia group.圖4 L－型鈣通道阻滯劑對缺氧誘導的心室肌細胞線粒體脫氫酶活性降低的影響

心肌細胞胞漿內游離的 Ca2+交替通過影響Ca2+敏感的離子通道，如鈉－鈣交換體、L－型鈣通道以及鈣激活的氯通道等，引起動作電位時程(action potential duration，APD)的改變。由于這些鈣敏感的離子通道對Ca2+的反應各異，有的是使APD延長，有的是使APD縮短，從而導致APD的交替性變化，進而誘導惡性心律失常的發生［4］。快速起搏和心肌缺血/缺氧均是鈣瞬變交替的重要影響因素，因此本研究首先在成年SD大鼠心室肌細胞觀察了快速起搏刺激對心室肌細胞鈣瞬變交替的影響。結果顯示，在正常培養基中，低頻起搏可引起鈣瞬變現象，即心室肌細胞胞漿中的Ca2+含量隨著刺激而發生一致性改變。但是，當快速起搏的頻率達到300 min－1時，心室肌細胞胞漿中的Ca2+含量的改變強弱交替出現，這說明單獨快速起搏可誘導心室肌細胞的鈣瞬變交替現象。這和本課題組前期在心房肌細胞上的研究結果類似［12］。

由于心肌缺血/缺氧也是引起惡性心律失常和心功能障礙的重要原因，因而，本研究接著觀察了缺氧對快速起搏引起心室肌細胞鈣瞬變交替的影響。研究發現，240 min－1的快速起搏刺激對正常培養的心室肌細胞的鈣瞬變無明顯影響，但是對缺氧的心室肌細胞可使其鈣瞬變的幅度強弱交替出現，提示缺氧可使快速起搏的心室肌細胞更容易發生鈣瞬變交替，即降低了快速起搏的刺激閾值。我們推測，臨床上心肌缺血時，心律失常容易發生的原因可能部分與此有關。此時，我們又通過顯微鏡照相發現，缺氧并未使心肌細胞橫紋及橫小管形態發生明顯改變，因而，認為鈣瞬變交替的發生早于心肌細胞橫紋及橫小管形態結構的改變，即在未發生上述細胞形態改變時，胞內已經存在鈣穩態的異常。

在缺血/缺氧的情況下，心室肌細胞的能量代謝障礙，線粒體功能也發生不同程度的受損。另外，缺血/缺氧還會引起心室肌細胞的Ca2+敏感離子通道(如L－型鈣通道)功能和細胞內 Ca2+的水平變化［13］。有研究顯示，選擇性L－型鈣通道阻滯劑VP可以抑制鈣瞬變的發生，改善鈣穩態失衡［14］。為此，本研究又觀察了鈣瞬變交替對缺氧引起的心室肌細胞線粒體功能的影響。研究結果顯示，缺氧處理可明顯降低心室肌細胞線粒體脫氫酶的活性，使其代謝WST－8產生黃色物質的能力減弱。而給予VP可以部分恢復心肌細胞線粒體的功能，此結果提示，鈣瞬變交替可能介導了持續缺氧誘導的心室肌細胞線粒體功能受損和心功能障礙，Katra等［14］在豚鼠心臟上的研究支持本文的結果。

總之，本文在成年SD大鼠心室肌細胞觀察到缺氧可以易化快速起搏刺激誘導的心室肌細胞鈣瞬變交替，而鈣瞬變交替又介導了持續缺氧誘導的線粒體功能受損。本文的研究結果為以缺氧為靶點的惡性心律失常和心功能障礙的防治提供了基礎資料。

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