疏肝健脾方對NASH大鼠肝組織IKKβ mRNA和蛋白表達的影響*

魏 波， 楊欽河△， 王文晶， 胡巢鳳， 方梅霞， 刑會杰，張玉佩， 程少冰， 王彥平， 馮高飛， 何秀敏， 徐擁建， 閆海震， 黃 進

(暨南大學醫學院1中醫系，2病理生理學教研室，國家中醫藥管理局病理生理三級實驗室，3實驗動物管理中心，廣東廣州510632)

核因子κB(nuclear factor κB，NF－κB)抑制蛋白激酶(inhibitor κB kinase，IKK)復合體是NF－κB信號通路的主要調節物，IKKβ是IKK復合體中的一個催化亞基，通過經典途徑激活NF－κB，參與免疫應答、炎癥反應等一系列病理生理過程［1］，實驗證明IKKβ在NF－κB信號通路活化過程中發揮重要的作用［2－3］。有研究表明，在非酒精性脂肪性肝炎(non－alcoholic steatohepatitis，NASH)動物模型和NASH患者中，肝臟NF－κB的表達水平均有顯著升高［4－5］，NF－κB的激活可能是肝臟和全身胰島素抵抗(insulin resistance，IR)的根源，參與NASH的發病，因此，抑制NF－κB蛋白和mRNA的表達，可能成為有效防治NASH的途徑之一。鑒于NF－κB在NASH發病中的重要作用，而IKKβ又是NF－κB炎癥信號通路的重要調節物，所以進一步深入探討IKKβ在NASH發病中的作用具有十分重要的意義。我們的前期的研究［5－9］表明，疏肝健脾方有較好抗非酒精性脂肪性肝病(non－alcoholic fatty liver disease，NAFLD)的作用，但是在NASH階段是如何發揮藥理作用的還不清楚，所以本實驗通過觀察大鼠血清炎癥細胞因子及肝組織IKKβ mRNA及其磷酸化蛋白在疏肝健脾方干預后的變化，探討疏肝健脾方抗NASH的分子機制，為NASH的中醫藥防治提供實驗依據。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 SPF級雄性SD大鼠72只，體質量(200 ±20)g，購于廣州中醫藥大學實驗動物中心，實驗動物許可證號為SCXK(粵)2008－0020;粵監證字為2008A020。

1.2 實驗用藥 (1)疏肝方(柴胡疏肝散)組成:柴胡6 g、川芎5 g、枳殼5 g、陳皮6 g、白芍5 g、香附5 g和炙甘草3 g;(2)健脾方(參苓白術散)組成:人參15 g、白術15 g、茯苓15 g、薏苡仁9 g、砂仁6 g、山藥15 g、桔梗6 g、白扁豆12 g、蓮子9 g和炙甘草9 g; (3)綜合方，即:柴胡疏肝散與參苓白術散的合方。

上述藥物均為深圳華潤三九醫藥股份有限公司中藥配方顆粒劑，購自暨南大學附屬第一醫院中藥房。疏肝方及健脾方組成、劑量均參考《方劑學》教材［10］。各組低劑量組藥量為人臨床等效劑量，高劑量組藥量為人臨床等效劑量的3倍用量。

1.3 主要試劑 Quant cDNA第1鏈合成試劑盒和SYBR Green熒光定量 PCR試劑盒購自北京天根生化科技有限公司;腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor－alpha，TNF－α)測定ELISA試劑盒購自北京達科為生物技術有限公司;白細胞介素6(interleukin－6，IL－6)測定ELISA試劑盒和IL－1測定ELISA試劑盒購自深圳欣博盛生物科技有限公司;內參照GAPDH蛋白抗體、IKKβ蛋白抗體及其磷酸化蛋白抗體購自Cell Signaling Technology;BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

2 方法

2.1 動物分組及給藥 所有大鼠適應性喂養1周后，按隨機數字表法隨機分為:正常對照組(灌服蒸餾水)、模型組(灌服蒸餾水)、疏肝方高劑量組(灌服9.6 g·kg－1·d－1劑量的柴胡疏肝散)、疏肝方低劑量組(灌服3.2 g·kg－1·d－1劑量的柴胡疏肝散)、健脾方高劑量組(灌服30.0 g·kg－1·d－1劑量的參苓白術散)、健脾方低劑量組(灌服10.0 g· kg－1·d－1劑量的參苓白術散)、綜合方高劑量組(灌服39.6 g·kg－1·d－1劑量的柴胡疏肝散和參苓白術散合方)和綜合方低劑量組(灌服13.2 g·kg－1· d－1劑量的柴胡疏肝散和參苓白術散合方)，每組均9只。各組大鼠分籠飼養，均自由進食和飲水。

2.2 大鼠NASH模型建立 大鼠NASH實驗模型的建立參照我們以往的方法［5－7］，并加以改進。正常對照組大鼠以基礎飼料喂養，其它各組均以高脂飼料(基礎飼料88%、豬油10%、膽固醇1.5%、膽鹽0.5%)喂養，在施以造模因素的同時，按照10 mL/kg分別灌胃給予正常組和模型組大鼠蒸餾水，各藥物組大鼠相應的藥物劑量按大鼠體表面積折算，每天早晚各1次。每天上午定時更換大鼠高溫消毒飲用水和添加飼料。各組動物自由飲水進食，分籠飼養于(24±2)℃室溫、明暗各12 h的暨南大學醫學院病理生理學動物實驗室內，每周定時稱重1次，根據體重調整給藥量，連續16周。

2.3 標本采集及樣本制備 各組動物均于末次給藥后，禁食不禁水12 h，所有大鼠以3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉(1 mL/kg)，腹主動脈采血，取血后迅速摘取肝臟，距離肝邊緣0.5 cm處取相同部位肝右葉組織，用于相關檢測(注:因灌胃不當，正常組、健脾高、低劑量組大鼠各死亡1只)。

2.3.1 病理染色 取距離肝右緣約0.5 cm處相同部位肝組織小塊，大小約1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm，經10%中性甲醛溶液固定標本，常規脫水、石蠟包埋，作3 μm連續切片，常規HE染色，光鏡下觀察各組大鼠肝組織病理學改變。

2.3.2 血脂及肝脂檢測 腹主動脈采血，室溫靜置30 min，4℃、3 000 r/min離心10 min，分離血清，用全自動生化分析儀檢測血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high－density lipoprotein cholesterol，HDL－C)和低密度脂蛋白膽固醇(low－density lipoprotein cholesterol，LDL－C)的含量;取肝組織100 mg加入0.9 mL異丙醇中，勻漿，于4℃、3 000 r/min離心10 min，吸取上清液，用全自動生化分析儀檢測肝組織勻漿TC、TG的含量。

2.3.3 血清炎癥細胞因子測定 從每組中隨機抽取8只大鼠，將其由腹主動脈取血5 mL注入試管中，搖勻后4℃、3 000 r/min離心10 min，分離血清，置于－80℃保存待測，用ELISA法檢測TNF－α、IL－6和IL－1的濃度，具體操作嚴格按照說明書進行。

2.3.4 肝組織IKKβ mRNA測定 取肝組織約50 mg用Trizol法抽提總RNA，用核酸微量分光光度計檢測總RNA的純度及濃度，要求A260/A280在1.8～2.0，根據所測RNA的濃度值，將每管RNA的濃度調至2 g/L準備下一步反轉錄;采用Quant cDNA第1鏈合成試劑盒依照說明書進行逆轉錄反應;以GAPDH為內參照，采用實時熒光定量 RT－PCR進行IKKβ和GAPDH產物擴增及結果分析。登陸Gen-Bank獲得IKKβ(NM_053355.2)和GAPDH(NM_ 017008.3)的cDNA序列，引物由上海捷瑞生物工程有限公司設計并合成，IKKβ上游引物5’－CCGTGACTGTTGACTACTG －3’，下游引物 5’－GTCCACTTCGCTCTTCTG－3’;GAPDH上游引物5’－CAAGTTCAACGGCACAGTCAA－3’，下游引物5’－TGGTGAAGACGCCAGTAGACTC－3’。反應體系:2.5×Real－time Master Mix/20×SYBR solution 9 μL，上、下游引物各2 μL，DNA模板1 μL，加滅菌雙蒸水補至總體積20μL。PCR反應條件:95℃預變性1 min，95℃變性10 s，GAPDH 57.5℃、IKKβ 52℃ 退火20 s，68℃延伸30 s，擴增40個循環，反應完成后再于72～95℃，持續5～10 s繪制熔解曲線。反應完畢，采用Opticon Monitor 3.1軟件分析結果，用公式2－ΔΔCt方法進行相對定量。Ct值=每個反應管內的熒光信號到達所設定的域值時所經歷的循環數，ΔΔCt=(Ct目的基因－ Ct內參基因)實驗組－ (Ct目的基因－Ct內參其因)空白組，以未處理的空白組基因表達水平為1，2－ΔΔCt為實驗組目的基因的表達相對于空白組的變化倍數。

2.3.5 肝組織IKKβ磷酸化蛋白測定 取肝組織約50 mg，在冰凍緩沖液中研碎，加入去污劑蛋白裂解液(含苯甲基磺酰氟)400 μL進行總蛋白的提取，用碧云天BCA蛋白濃度試劑盒測定樣本蛋白的濃度，計算取含蛋白40 μg的溶液體積為上樣量，加入樣品處理液，煮沸7～10 min，SDS－PAGE電泳120 min轉至PVDF膜后，室溫下用5%脫脂奶粉(脫脂奶粉+TBST)封閉1.5 h;洗膜后加I抗，室溫孵育2 h(或4℃過夜)，TBST漂洗3次，每次10 min;加II抗，室溫孵育1.5 h，TBST漂洗3次，每次5 min。將碧云天化學發光液A液和B液約1 mL充分混勻后鋪于膜正面，室溫1～3 min后，去除膜表面的殘液，置于曝光盒中曝光、顯影、定影。用Quantity One軟件掃描各條帶的吸光度(A值)并分析結果，以GAPDH作為內參照進行半定量分析。

3 統計學處理

數據用SPSS 13.0統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，多樣本組間均數比較采用單因素方差分析(One－way ANOVA)，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 各組大鼠肝組織病理變化

光鏡下正常組大鼠肝組織結構完整，肝小葉結構規則，肝索整齊，肝細胞呈多邊形，邊界清，胞內無脂滴沉積。模型組大鼠肝組織脂肪變性明顯，可見肝索紊亂，肝小葉內、匯管區炎癥細胞浸潤，肝細胞腫脹，胞漿內脂滴大小不一，以大泡性脂肪滴為主，胞核被擠向邊緣，難以找到正常的肝細胞。上述改變提示NASH造模成功，呈中重度脂肪變，病理模型成功。各藥物干預組大鼠肝組織可見脂滴空泡均有不同程度減少，肝小葉、匯管區炎癥細胞浸潤情況均較模型組有不同程度的改善，其中以綜合方高劑量組改善最為明顯，見圖1。

Figure 1.Pathological changes of rat hepatic tissues from each group(HE staining，×200).圖1 各組大鼠肝組織病理變化

2 各組大鼠血脂及肝脂的變化

與正常組相比，模型組大鼠血清中TC、LDL－C及肝組織TC、TG均有顯著升高(P＜0.01)，血清TG有升高，但無統計學意義(P＞0.05);與模型組相比，各藥物干預組大鼠的血脂均有不同程度的下降，其中血清TG以綜合方高、低劑量組及健脾方高劑量組下降較為明顯(P＜0.01，P＜0.05)，肝組織TG含量以綜合方高、低劑量組、健脾方高劑量組及疏肝方高劑量組下降顯著(P＜0.01，P＜0.05)，肝組織TC含量以綜合方高劑量組下降明顯(P＜0.01)，見表1、2。

表1 各組大鼠血清TC、TG、HDL－C和LDL－C含量的比較Table 1 .The serum levels of TC，TG，HDL－C and LDL－C in rats from each group(mmol/L.±s)

表1 各組大鼠血清TC、TG、HDL－C和LDL－C含量的比較Table 1 .The serum levels of TC，TG，HDL－C and LDL－C in rats from each group(mmol/L.±s)

＊＊P＜0.01 vs normal group;▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs model group.

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表2 各組大鼠肝組織TC和TG含量的比較Table 2 .The content of TC and TG in rat hepatic tissues from each group(mmol/L.±s)

表2 各組大鼠肝組織TC和TG含量的比較Table 2 .The content of TC and TG in rat hepatic tissues from each group(mmol/L.±s)

＊＊P＜0.01 vs normal group;▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs model group.

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3 各組大鼠血清炎癥細胞因子的變化

與正常組比較，模型組大鼠血清TNF－α、IL－1和IL－6含量均有明顯升高(P＜0.01，P＜0.05);與模型組相比，各藥物組大鼠血清TNF－α和IL－6含量有不同程度的下降，其中各藥物組的高劑量組均比相應的低劑量組改變明顯，TNF－α含量以疏肝方高劑量組、健脾方高劑量組和綜合方高、低劑量組下降明顯(P＜0.01，P＜0.05);IL－1和IL－6含量均以綜合方高劑量降低顯著(P＜0.05)，見表3。

表3 各組大鼠血清TNF－α，IL－1和IL－6水平變化的比較Table 3 .The serum levels of TNF－α，IL－1 and IL－6 in rats from each group(ng/L.±s.n=8)

表3 各組大鼠血清TNF－α，IL－1和IL－6水平變化的比較Table 3 .The serum levels of TNF－α，IL－1 and IL－6 in rats from each group(ng/L.±s.n=8)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs normal group;▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs model group.

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4 各組大鼠肝組織IKKβ mRNA的表達水平

實時熒光定量RT－PCR結果顯示，以未做任何處理的正常組作為對照組，與正常對照組比較，模型組大鼠肝組織IKKβ mRNA的表達水平顯著升高(P＜0.01);與模型組相比，肝組織IKKβ mRNA的表達水平以綜合方高劑量組及健脾方高劑量組下降最為顯著(P＜0.05)，其余藥物干預組IKKβ mRNA的表達水平也有不同程度下降，但無統計學意義(P＞0.05)，見圖2。

5 各組大鼠肝組織IKKβ磷酸化蛋白的表達水平

Western bloting檢測結果顯示，各組大鼠肝組織內均有IKKβ磷酸化蛋白的表達，長期高脂飲食作用，IKKβ蛋白被顯著磷酸化，與正常組相比，模型組大鼠肝組織IKKβ磷酸化蛋白的表達水平明顯升高(P＜0.01);與模型組比較，各藥物組大鼠肝組織IKKβ磷酸化蛋白的表達水平均有不同程度下降，且各藥物組的高劑量組均比相應的低劑量組下降明顯，IKKβ磷酸化蛋白的表達水平以健脾方高劑量組及綜合方高、低劑量組下降最為顯著(P＜0.01，P＜0.05)，見圖3。

討論

NASH作為 NAFLD的一種病理分型，處于NAFLD疾病譜中的關鍵階段，是單純性脂肪肝向肝纖維化、肝硬化進展的重要中間環節，而且有研究報道NASH相關的肝硬化是肝細胞癌發生的獨立危險因素之一［11－12］。NASH發生機制尚未完全闡明，由糖、脂代謝紊亂到炎癥細胞因子分泌增加，再到肝臟慢性亞臨床炎癥狀態的形成、內皮細胞功能的失調，進一步刺激大量炎癥細胞因子和過氧化物釋放，損傷肝細胞，破壞肝功能，這是脂肪性肝炎、肝纖維化發生、發展的演變過程，致炎因子與抗炎因子失平衡觸發氧應激和脂質過氧化反應作為重要機制參與其中。本實驗在用高脂飲食成功建立NASH大鼠模型的基礎上，研究發現模型組大鼠存在明顯血脂、肝脂代謝紊亂，血清炎癥細胞因子TNF－α、IL－1和IL－6含量、肝組織IKKβ mRNA及其磷酸化蛋白的表達水平均較正常組明顯升高(P＜0.01，P＜0.05)，且IKKβ mRNA及磷酸化蛋白表達變化基本一致，提示高脂飲食可能在蛋白和基因兩個水平上調肝臟IKKβ的表達，這與國內外的研究結果相一致［13－14］。進一步提示了IKKβ可能在促進NASH的發生發展中具有重要的作用和意義。

Figure 2.Expression of IKKβ mRNA in rat hepatic tissues from each group measured by real－time fluorescence quantitative RT－PCR.1:normal group;2:model group; 3:Shu－gan recipe high dose group;4:Shu－gan recipe low dose group;5:Jian－pi recipe high dose group;6:Jian－pi recipe low dose group;7:composite recipe high dose group;8:composite recipe low dose group.±s.n=8.＊＊P＜0.01 vs normal group;▲P＜0.05 vs model group.圖2 實時熒光定量RT－PCR檢測各組大鼠肝組織IKKβ mRNA的相對表達水平

Figure 3.Expression of p－IKKβ protein in rat hepatic tissues from each group.1:normal group;2:model group; 3:Shu－gan recipe high dose group;4:Shu－gan recipe low dose group;5:Jian－pi recipe high dose group;6:Jian－pi recipe low dose group;7:composite recipe high dose group;8:composite recipe low dose group.±s.n=3.＊＊P＜0.01 vs normal group;▲P＜0.05 vs model group.圖3 各組大鼠肝組織IKKβ磷酸化蛋白的表達

研究表明IKKβ通過2種方式參與NASH的發病［15－16］:(1)IKKβ作為一種 Ser/Thu蛋白激酶，可使胰島素受體底物 1(insulin receptor substrate1，IRS1)特定位點的絲氨酸殘基磷酸化，減弱胰島素受體與IRS1的結合、阻止胰島素信號向下游磷脂酰肌醇3－激酶(phosphatidylinositol 3－kinase，PI3K)的傳遞，從而削弱胰島素刺激的葡萄糖攝取和糖原合成，使三磷酸腺苷儲備減低，導致IR的發生，IR是NASH發生的中心環節，且貫穿NASH發病的始終; (2)IKKβ被氧化應激、細胞因子、生長因子、細菌和病毒及其代謝產物等諸多因素激活后顯著磷酸化，p－IKKβ可活化IκB，使之降解與NF－κB解離，活化后NF－κB移位至核內，促進多種炎性因子及炎性相關物質大量釋放和表達，如TNF－α、IL－1、IL－6、INF－β等。這些炎癥因子不僅可以直接誘導肝臟的炎癥損傷，也可以反饋加強IKKβ的活化。在炎癥反應的復雜細胞因子網絡中，IKKβ/NF－κB信號途徑是炎癥反應的關鍵信號通路，IKKβ對IκB的磷酸化是NF－κB激活的一個關鍵步驟，有實驗已證實IKKβ是促炎因子激活NF－κB所必需的IKK亞基［17］。IKKβ調節和控制著NF－κB活化，阻斷這一重要環節，減輕TNF－α、IL－1、IL－6等炎癥細胞因子對肝臟的損害，對于防治NASH及阻止肝纖維化、肝硬化病理進程意義非常重大。

本研究結果顯示，疏肝健脾方可通過降低血清TG、LDL－C及肝組織TC、TG的含量而調節NASH大鼠脂質代謝，改善肝組織病理損傷及炎癥浸潤，與模型組相比，各藥物干預組大鼠血清TNF－α、IL－1和IL－6的含量、肝組織IKKβ mRNA及其磷酸化蛋白的表達水平均有不同程度降低，以綜合方高劑量組及健脾方高劑量組下降最為明顯(P＜0.01，P＜0.05)，且各藥物的高劑量組下降水平均優于相應的低劑量組。這提示疏肝健脾方可能是通過下調肝組織IKKβ mRNA及其磷酸化蛋白的表達、抑制炎癥細胞因子的分泌和合成，調節脂質代謝紊亂，改善肝組織脂肪變性及炎癥狀態，從而發揮抗NASH的作用。IKKβ磷酸化蛋白可能是疏肝健脾方藥發揮藥理作用的重要靶點之一。實驗結果還表明用疏肝健脾綜合方的高劑量和健脾方的高劑量收效更好，提示疾病由NAFLD進展至NASH階段肝郁脾虛病機可能較為嚴重，并且在疾病的后期可能多以脾虛偏重為主，以方測證，我們可推斷肝郁脾虛且以脾虛為主可能是NASH階段的重要病機。肝郁脾虛的病機貫穿于NAFLD的發生發展自始至終，那么在這一過程中究竟是以肝郁為主，還是脾虛為主，或是肝郁脾虛并重，值得深入探討。同時各藥物的高劑量組優于相應的低劑量組，提示疏肝健脾方對NASH的干預存在一定的量效依賴關系，為以后的進一步深入研究提供了重要依據。

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