組織工程構建人工心臟瓣膜的研究進展

馬 浩，石海燕，張 曉 綜述 王 奇 審校

心臟瓣膜病是危及人類健康的一種常見疾病，人工瓣膜置換術是其主要治療方法。目前臨床應用的人工瓣膜分為機械瓣和生物瓣兩種，均可有效改善血流動力學，但非生長性瓣膜［1］。組織工程化心臟瓣膜(tissue－engineering heart valve，TEHV)是利用組織工程技術將受體細胞種植于支架上所構建的一種人工瓣膜，其結構和功能與正常瓣膜相似，具有可生長性和自我修復能力，理論上能克服機械瓣和生物瓣的不足。構建TEHV 的基本思路:采用人工合成材料或同種/異種的脫細胞心臟瓣膜作為支架，將體外擴增的自體活細胞種植于支架上，細胞黏附生長并分化，使其具備正常瓣膜組織的新陳代謝功能，從而應用于臨床。因此，TEHV 的研究包括瓣膜支架的制備、種子細胞的選擇與培養、細胞種植與體外預適應。近年來隨著組織工程技術的發展，TEHV 的研究取得一定進展。

1 瓣膜支架的制備

瓣膜支架是構建TEHV 的基礎，理想的瓣膜支架做為細胞貼附生長的模板，不僅要提供足夠的機械強度，以承受血流沖擊所產生的張力和剪切力，同時又要求提供種子細胞的生長空間和微環境。因此，瓣膜支架應具備以下特性［2］:(1)足夠的力學強度，為新生組織提供支撐，直至新生組織具備自身力學特性;(2)良好的生物相容性，無明顯的致炎性、免疫原性和細胞毒性;(3)良好的材料－細胞界面，利于種子細胞黏附和增殖;(4)三維多孔立體結構，為種子細胞提供生長空間和微環境;(5)良好的可降解性，植入體內后的降解速度應與細胞的生長速度相匹配;(6)易于消毒。目前研究的瓣膜支架有3 種:人工高分子支架、天然高分子支架和經脫細胞處理后的生物源性瓣膜支架［3］。

1.1 人工高分子支架 根據TEHV 支架的要求，可降解材料無疑是最好的材料。目前常用的有聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)及二者的共聚物(PLGA)等。PGA 易于吸收降解，做為細胞支架被廣泛應用于組織工程中，但PGA 缺乏結構穩定性，在組織培養中降解快，較難維持預先設計的形狀，而PLA、PLGA 吸收相對較慢，穩定性相對較好，因此將PLA/PLGA 和PGA 按一定比例混合，能更好地控制降解速率和保持預設形狀。此類支架的缺點有［3，4］:(1)缺乏細胞識別位點，影響種子細胞的黏附，細胞易于脫落。為增強細胞黏附，目前發展了多種修飾技術以改善其表面特性，包括在材料表面包埋富含精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸序列的細胞外基質成份，用氫氧化鈉處理或乙醇和水兩步預濕等。(2)機械強度不足。單純PGA 無紡網不具備良好的抗壓強度，通過PLA 包埋或熱處理可改善其機械強度，但仍存在抗壓強度不足的缺陷。(3)降解產物的致炎性。目前認為高分子支架植入體內后可導致無菌性炎性反應，這與酸性降解產物引起局部PH 值下降有關，有學者將堿性物質引入聚合物中以預防其發生。

1.2 天然高分子支架 天然高分子材料包括膠原蛋白、海藻酸酸鹽、透明質酸等。文獻［5］報道使用纖維蛋白凝膠做為細胞支架，可以構建完全自體來源的人工瓣膜。其特點:瓣膜結構完全來自自體，降解速度可調節，細胞擴散更均勻等。此類支架包含生物活性物質，利于細胞增殖;但生物力學性能較差，可塑性不強，不具備組織培養的立體結構，來源有限、加工困難，限制了其實際應用。

1.3 生物源性瓣膜支架 生物源性瓣膜支架采用同種異體或異種心臟瓣膜，通過脫細胞處理消除免疫原性，并保持正常瓣膜的三維空間，既有較好的抗張強度，又能提供細胞外基質。細胞外基質由膠原、黏多糖和透明質酸組成，為細胞生長提供了微環境，與種子細胞相互作用，調節各種細胞因子和生長因子的活性，間接激活細胞間的信號傳遞，促進種子細胞黏附、遷移、生長和分化［6，7］。目前此類支架在構建TEHV 的研究中得到越來越多的關注。

此類支架有同種和異種兩類。同種支架是將同種異體細胞脫去后種植受體細胞，可有效抑制免疫反應，減慢瓣膜衰敗過程，生物學和力學特性穩定［8］。但因同種支架取材受限，目前研究多限于肺動脈瓣，異種支架應更具研究前景。異種支架的優點是可降低因細胞碎片而引發的瓣膜鈣化和衰敗，同時細胞黏附率也高于人工高分子支架。目前研究最多的異種支架是經過脫細胞處理的豬主動脈瓣，在解剖形態、組織結構、組成成份和機械強度等方面和人類瓣膜相近，且來源充足。Kasimir 等［9］體外分別種植內皮細胞和間質細胞，結果顯示此種支架有良好的生物相容性。但Hopkins等［10］認為其易于傳染種間細菌和病毒。由于缺乏長期大規模動物實驗，目前很難評價它與高分子支架之間的優劣。

脫細胞方法包括機械法、去污劑法和酶消化法［11］，并結合滲透溶液法進行輔助。常用去污劑有Triton X－100(聚乙二醇辛基苯基醚)、SDS(十二烷基硫酸鈉)和SD(脫氧膽酯酸鈉)，處理后的組織成份為膠原、彈性蛋白、纖維黏連蛋白和層黏連蛋白。常用消化酶為胰蛋白酶，處理后的組織成份為彈性蛋白、膠原和糖性蛋白。此外，在上述脫細胞基礎上使用核酸酶水解細胞內的DNA 和RNA，可以減少或消除豬內源性逆轉錄病毒的污染［12］。

2 種子細胞的選擇和培養

種子細胞是構建TEHV 的關鍵，理想的種子細胞應具備:(1)取材簡便;(2)體外增殖能力強;(3)能適應支架環境;(4)可通過分子生物學技術進行基因修飾。目前常用的種子細胞有:自體組織細胞、成體干細胞、胚胎干細胞和其他細胞等。早期多采用自體細胞，但受其取材限制，干細胞作為種子細胞的研究逐漸深入。

2.1 自體組織細胞 自體組織細胞包括:血管內皮細胞、血管或皮膚的成纖維細胞或肌成纖維細胞等。從理論上看，大動脈的結構、功能與心臟瓣膜有一定的相似性，因而動脈血管壁細胞較符合構建TEHV 的要求，但動脈血管取材有限、創傷大;靜脈血管易于獲取且安全，膠原產生能力高于動脈血管細胞，目前已有靜脈內皮細胞構建TEHV 的少量報道［13］。自體組織細胞做為種子細胞也有一定的缺點，組織細胞屬于終末細胞，體外擴增能力較弱，需要犧牲大量血管才能獲得足夠細胞，其應用受到限制。

2.2 成體干細胞 成體干細胞具有自我更新和多向分化能力，有可能成為理想的組織工程種子細胞，并最終利用成體干細胞構建出完全意義上的TEHV。目前間充質干細胞研究最多。骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)是中胚層發育的具有自我更新和多向分化潛能的成體干細胞，易于獲取和分離，體外培養和增殖后多向分化潛能并不減弱，傳代后的純度可達95%以上［14］，是較為理想的TEHV 種子細胞。成人骨髓中BMMSCs 含量較少，每1 ×105的單個核細胞中有2 ～5 個BMMSCs［15］，需體外純化和擴增，方法有:全骨髓培養法、貼壁篩選法、免疫磁珠法和密度梯度離心法［16］。提取的BMMSCs 在誘導因子作用下能分化成骨骼、平滑肌、心肌和血管內皮等多種組織細胞。Potapova 等［17］指出血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是誘導BMMSCs 分化為內皮細胞的關鍵。BMMSCs 在改良Eagle's 細胞培養液(dulbecco’s modified eagle’s medium，DMEM)+胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的培養液中部分表達成纖維細胞和肌成纖維細胞的重要標志物波形蛋白和α－肌動蛋白，表明BMMSCs 有可能自然分化為成纖維細胞，但BMMSCs 在普通培養環境中是否能夠完全分化為成纖維細胞，目前缺乏相關研究。

2.3 胚胎干細胞 胚胎干細胞來源于囊胚的內細胞團，可持續增殖而不分化，經誘導后具備分化形成各類細胞的潛能。在合適的體外培養條件下，胚胎干細胞能分化為內皮細胞和肌成纖維細胞，Tutter 等［18］將人的胚胎干細胞種植在鼠胚成纖維細胞飼養層上，胚胎干細胞自動分化為血管內皮細胞。但目前尚不能建立無免疫原性的人胚胎干細胞系，更重要的是其研究亦受到倫理制約。

2.4 其他細胞 內皮前體細胞(endothelial precursor cell，EPC):存在于成人骨髓及外周血中，由CD34+造血干細胞定向分化而來，VEGF 是CD34 +定向分化為EPC 的關鍵［19］。在體外可誘導形成內皮細胞，并穩定傳代30 代以上，表明EPC 可做為構建TEHV 內皮層的種子細胞。

臍血細胞:Schmidt 等［20］將臍血細胞種植于人工高分子支架后置入生物反應器中培養，結果顯示培育的組織具有內皮功能并能產生細胞外基質。這表明臍血細胞可以是一個新的TEHV 種子細胞來源。目前利用EPC 和人臍血細胞做為構建TEHV 種子細胞的研究報道較少，尚無法評價其做為TEHV 種子細胞來源的可行性。

3 細胞種植與體外預適應

種子細胞在瓣膜支架上的種植受到多種因素的影響，如細胞密度、支架表面修飾、種植時間間隔、種植方式和環境等。

3.1 細胞種植 細胞在三維結構上的分布和黏附受限于細胞重力因素，未黏附細胞會迅速脫落。提高種子細胞數量有助于細胞黏附，細胞密度多在105～106/cm2。間隔24 ～36 h重復種植明顯優于間隔2 ～12 h 種植。

細胞與支架黏附主要由黏附因子和細胞外基質分子相互作用介導，基質分子包括膠原、纖維黏連蛋白(Fn)和層黏連蛋白(Ln)等。目前用Fn 和Ln 等包被支架已成為提高細胞黏附的重要手段，也可在支架表面進行固定氨基酸、多肽類物質或細胞因子的改性處理，以提高種植效率。

細胞種植的方法有單層種植和復合種植、二維培養和三維培養、靜態培養和動態培養等。單層種植是將單類種子細胞種植在支架上，目前構建TEHV 的研究絕大多數集中在內皮細胞、成纖維細胞或干細胞等的單層種植上，但瓣膜組織是由內皮細胞、間質細胞(主要是成纖維細胞)和細胞外基質組成，并在此基礎上發揮生理功能，因此多種細胞復合種植于支架表面上應該是構建TEHV 的方向。復合種植分為分層種植和混合種植，前者按照瓣膜組織結構先種植成纖維細胞、后種植內皮細胞，后者是將這兩種細胞混合種植，細胞在支架內遷移、重新整合成接近正常的組織結構。目前復合種植在組織工程化人工血管和真皮的研究中取得了一定進展［21，22］，但在構建TEHV 的研究中尚缺乏報道。

二維培養是將細胞置于膜性支架上，細胞形成薄層培養物，但長時間培養細胞會老化，不能構建具有三維結構和功能的TEHV。三維培養是將細胞種植于具有一定空間結構的支架上，細胞在模擬體內細胞的微環境中生長分化，其黏附性和生物活性明顯優于二維培養。但種子細胞如何在具有空間結構的支架表面均勻分布是目前尚待解決的問題。

目前細胞培養大多采用靜態的方法，由于沒有承受脈沖血流的剪切力作用，離體培養時間越長，細胞分化能力越差。Flanagan 等［23］研究發現在剪切應力作用下培養的血管內皮細胞中出現應力纖維，其走向與細胞長軸一致。目前認為，應力環境是細胞生長和維持正常功能的一個重要因素，據此提出了動態培養的方法，并設計了生物反應器，為細胞生長提供旋轉、震蕩甚至類似體內血流的脈沖應力環境，種植后的細胞能更好地分化并維持正常生理功能。

3.2 體外預適應 研究發現體外培養的內皮細胞黏附力低，在體動物實驗中細胞易于脫落，其生理功能與正常細胞相比明顯不足，構建的TEHV 不能達到正常瓣膜的性能要求。目前絕大多數研究者認為血流動力學環境對內皮細胞生物學特性和生理功能的形成至關重要，可以促進細胞增殖并增強內皮細胞和成纖維細胞的粘附能力、軸向性生長及膠原產生能力等生物學特性。因此體外構建的TEHV 在植入體內之前必須經過模擬體內環境的預適應，能明顯改善細胞黏附力和瓣膜生物學特性［24］。理想的脈動生物反應器應具備以下條件［25］:從生物學角度要保證細胞的生長和代謝，材料無毒，系統密閉，恒溫無菌;從流體力學角度要模擬體內血流搏動，脈沖驅動，頻率、壓力和流量能逐漸上調。為模擬體內血流的脈動，學者們進行了大量的研究，Jansson 等［26］利用鐘擺原理設計了應力培養系統，瓣膜隨鐘擺在培養液里往復擺動，承受類似脈動流的應力。Lichtenberg 等［27］在瓣膜支架上種植體外培養的內皮細胞，置入生物反應器中培養8 天后觀察，結果顯示培養的細胞具有分層定向能力，細胞的增殖情況也好于非生物反應器培養條件下的細胞。但如何保證穩定的脈沖應力仍是目前研制生物反應器的關鍵和難點［28］。

4 TEHV 的體內驗證

經過體外培育和預適應的TEHV 需移植入體內進一步觀察，以評估其各方面性能。目前TEHV 的在體實驗研究多集中于動物實驗階段，短期效果良好，但遠期效果如機械性、抗血栓、抗鈣化和耐久性等尚待進一步研究。TEHV 植入動物體內3 ～6 個月后出現由中性粒細胞和巨噬細胞介導的瓣膜衰壞，但迄今為止僅少數病例應用TEHV 于臨床，無法得知植入體內后TEHV 的組織學結構，TEHV 距離實際應用尚有很長的研究歷程。

TEHV 作為瓣膜外科領域研究的課題，已經取得了相當大的進展，使我們看到了臨床應用的曙光。但這一新興技術仍處于探索階段，距離實際應用尚待解決許多技術問題，例如(1)如何完全消除瓣膜支架的免疫原性及其降解產物的致炎性;(2)在使用脫細胞瓣膜支架中尋找更為簡單有效的脫細胞方法;(3)短期內如何獲得大量種子細胞;(4)采用何種種植方式以提高細胞貼附;(5)研制更為接近體內血流環境的脈沖生物反應器等。這些都要求我們在細胞生物學、分子生物學、血流動力學、材料力學等領域做出更為深入細致的研究。

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