微生物固定法降解含聚廢水的最佳條件＊

劉江紅，潘 洋，徐瑞丹

（1.東北石油大學化學化工學院，黑龍江大慶 163318； 2.廈門大學生命科學學院，福建廈門 361005）

隨著采油技術不斷發展，先后經歷了1次、2次和3次采油.特別是3次采油，其本質就是為了改善驅油效果，向水中添加化學試劑，主要是聚合物、表面活性劑和堿.隨著采油用聚丙烯酰胺（HPAM）驅油的大量應用，使采油污水的成分更加復雜，采油污水中的聚丙烯酰胺對環境的污染日趨嚴重且難以處理［1］.因此含聚廢水處理成為一個急需解決的問題.

生物法處理含聚廢水是目前環保、有發展前景的方法，但目前生物法仍停留在利用游離態微生物降解含聚廢水階段，游離態微生物易流失，利用率低，且難以回收利用.本實驗采用微生物固定化方法處理含聚廢水，微生物固定化的優點在于利用物理或化學方法將游離的微生物定位在限定的空間區域，使其保持活性并可反復使用，在適宜的條件下還可以增殖.微生物固定化后，對有毒有害物質的抵抗能力及對有機物的降解能力都有明顯的提高［2］，同時固定化微生物技術能夠克服菌體易流失等缺點［3］.目前微生物固定化已經在工業、醫學、化學分析、能源開發等［4－5］領域得到廣泛的應用.固定化技術中的包埋法操作簡單，對微生物活性影響小，制作的固定化微生物小球的強度高［6］.固定劑聚乙烯醇（PVA）加熱后易溶于水，將微生物包埋固定在凝膠中.但PVA凝膠顆粒具有非常強的附聚傾向，使顆粒間黏結不易分開，顆粒的機械強度、沉降性、通透性也有待于提高.Rao等［7］用海藻酸鈉固定化乳酸桿菌用來生產純L（＋）乳酸以評價小球的穩定性.海藻酸鈉無毒不易被降解，但海藻酸鈉法包埋形成的凝膠小球抗沖擊負荷能力差［8］.

因此，本實驗采用微生物固定化技術中的包埋法處理含聚廢水，選用海藻酸鈉與聚乙烯醇結合的新型包埋劑組合，希望增強固定化小球的機械強度、沉降性、通透性和抗沖擊負荷能力，以增強對含聚廢水中HPAM的降解能力，同時對海藻酸鈉－聚乙烯醇固定法的制備條件進行研究，尋找降解含聚廢水的最佳固定化制備條件.

1 實驗材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 主要設備

722型分光光度計，上海光譜儀器有限公司；高速離心機，長沙英泰儀器有限公司；電子天平，島津國際貿易有限公司；高壓滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；pH計，上海虹益儀器儀表有限公司；恒溫振蕩培養箱，上海森信實驗儀器有限公司；冰箱，泰州樂金電子冷機有限公司；電爐，天津市泰斯特儀器有限公司；接種環；接種針；酒精燈；膠頭滴管；棉塞；玻璃儀器等.

1.1.2 菌株來源

實驗室保藏菌株，篩選自大慶采油廠含聚廢水，命名為R4－1，R4－2，R4－3，R4－5，H4－3.實驗室初步鑒定R4－1為芽孢乳桿菌屬，R4－2為微球菌屬，R4－3為芽孢桿菌屬，R4－5為芽孢八疊球菌屬，H4－3為芽孢桿菌屬.

1.1.3 培養基

1）保藏培養基和富集培養基：牛肉膏蛋白胨培養基.2）活化培養基（用于降解聚丙烯酰胺菌株活化）：聚丙烯酰胺0.5g，尿素9g，蛋白胨6g，KH2PO40.5g，NaCl 0.5g，MgSO40.5g，蒸餾水1 000mL.3）基礎培養基：聚丙烯酰胺0.5g，蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化鈉5g，加蒸餾水到1 000 mL調至pH＝7.0.主要用于利用混合菌降解聚丙烯酰胺.（淀粉－碘化鎘法測得大慶采油廠的含聚廢水中聚丙烯酰胺的質量濃度為500.24mg·L－1）.

1.1.4 試 劑

三水合硫酸鋁，天津市塘沽鵬達化工廠；冰醋酸，天津市博迪化工有限公司；七水合硫酸亞鐵，天津市博迪化工有限公司；碘化鎘，北京恒業中遠化工有限公司；海藻酸鈉，天津市凱通化學試劑有限公司；氟化氫銨，聚乙烯醇（PVA），天津市四通化工廠；無水氯化鈣，天津市天達凈化材料精細化工廠；SiO2，上海化學試劑總廠；CaCO3，天津市大茂化學試劑廠；硼酸，天津市博迪化工有限公司；活性碳，天津市塘沽天達凈化材料精細化工廠，以上試劑均為分析純；可溶性淀粉，生物試劑，北京奧博星生物技術有限責任公司；聚丙烯酰胺，大慶采油廠.

1.2 實驗方法

1.2.1濕菌體制備

聚丙烯酰胺是難降解的高分子聚合物，需要利用微生物的共代謝作用，因此選取混合菌作為實驗研究對象.將5種菌混合作為固定化菌體，利用活化培養基連續活化4次，以增強菌體對HPAM的適應和降解能力.取活化后的培養液2mL加入到富集培養基中培養2～3d，讓菌體大量繁殖，大量繁殖后的菌體經離心機離心，得到濕菌體.

1.2.2 微生物固定化

蒸餾水配置不同濃度配比的海藻酸鈉與PVA載體溶液，用5mL注射器吸取上述載體溶液，將其滴入按一定比例配置的交聯劑中，交聯一定時間，將含有菌體的固定化顆粒放入基礎培養基中，35℃，120r·min－1振蕩培養箱中培養去降解聚丙烯酰胺.

1.2.3 降解率的測定

淀粉－碘化鎘法測聚丙烯酰胺降解率，制作標準曲線.

1.2.4 固定化顆粒性能測定

1）固定化顆粒強度測試：將交聯24h的固定化顆粒經蒸餾水沖洗2次后，取出30個均勻的顆粒放入35℃，120r·min－1振蕩培養箱中.24h后觀察顆粒破損情況.

2）固定化顆粒滲透性測試：將顆粒沒入墨水中，5min后取出.分別在顆粒距中心0，1／2，1／4處切片觀察浸濕程度.每組數據為8顆顆粒測試平均值.

2 結果與討論

2.1 標準曲線繪制

以聚丙烯酰胺質量分數為橫坐標，OD420值為縱坐標繪制的吸光度與聚丙烯酰胺質量分數標準曲線，曲線的線性回歸方程為y＝0.038 5 x＋0.002 7，R2＝0.999 6.

2.2 海藻酸鈉－聚乙烯醇（PVA）固定化降解含聚廢水最佳條件研究

本實驗采用海藻酸鈉與PVA相結合作為固定化的包埋劑，對5種菌的混合菌進行固定化實驗.

2.2.1 海藻酸鈉質量分數對成球性的影響

分別配置質量分數為1%，2%，3%，4%，5%的海藻酸鈉溶液，將其滴入3%氯化鈣溶液中，成球難易程度如表1所示.由表1可以看出，海藻酸鈉質量分數一般在2%～4%時小球制作成型容易、速度快，凝膠的封閉性好.

表1 海藻酸鈉質量分數對固定化成球性的影響Tab.1 Effect of mass fraction of Sodium Alginate on ballability of immobilization

2.2.2 海藻酸鈉－PVA不同質量分數配比對固定化顆粒的影響

考慮到固定化顆粒制作難易程度，將海藻酸鈉－PVA混合液質量分數定位在8%，將海藻酸鈉與PVA按不同質量分數配比混合，滴入3%氯化鈣與3%的硼酸中，交聯24h.不同質量分數配比海藻酸鈉－PVA對成球性的影響如表2所示，不同質量分數配比海藻酸鈉－PVA固定化顆粒性能測定如表3所示.由表2與表3得知，由3%的海藻酸鈉和5%的PVA與4%的海藻酸鈉和4%的PVA制得的固定化顆粒形狀規則，成球速度快，且制備簡單.但3%的海藻酸鈉和5%的PVA固定化顆粒滲透性相對于4%的海藻酸鈉和4%的PVA固定化顆粒滲透性較差，且易破損.因此，決定選取4%的海藻酸鈉與4%的PVA作為微生物固定化的包埋劑.

表2 不同質量分數配比海藻酸鈉－PVA對成球性的影響Tab.2 Effect of different mass fraction of Sodium Alginate－PVA on ballability

表3 不同質量分數配比海藻酸鈉－PVA固定化顆粒性能測定Tab.3 Inspect of function on different mass fraction of Sodium Alginate－PVA immobilization kernel

2.2.3 海藻酸鈉－PVA固定化制備條件研究

濕菌體與包埋劑的體積比對微生物固定化降解聚丙烯酰胺有一定的影響，海藻酸鈉需要在氯化鈣中固化，而PVA需要在硼酸中固化.因此，選定濕菌體與包埋劑體積比、CaCl2溶液質量分數、硼酸溶液質量分數、CaCl2與硼酸分步交聯時間作為正交試驗的4個影響因素，每個因素選3個水平，考察固定化顆粒對HPAM降解率的影響，如表4所示.選用正交表L9（34）進行4因素3水平的正交實驗，以確定制備的含有活菌體的固定化顆粒降解聚丙烯酰胺的最佳條件.正交實驗數據及其極差分析結果如表5所示.

由表4和表5可知，在上述4種影響因素中，固定化制備條件對聚丙烯酰胺的降解率影響因素大小為：濕菌體與包埋劑體積比＞硼酸質量分數＞氯化鈣質量分數＞交聯時間.濕菌體與海藻酸鈉體積比對降解率的影響遠大于其他3個條件.最佳的固定化顆粒制備條件為A1B2C2D1，即當氯化鈣質量分數為2%和硼酸質量分數為3%，分階段交聯，在氯化鈣中交聯4h后轉入硼酸中交聯20h，濕菌體與包埋劑體積比為1∶1.濕菌體與包埋劑體積比對聚丙烯酰胺降解率的影響十分顯著.

方差分析結果如表6所示，濕菌體與包埋劑體積比對聚丙烯酰胺降解率影響十分顯著，交聯時間對降解率影響很小.

表4 正交實驗因素水平Tab.4 Levels and factors of orthogonal experiment

表5 L9（34）正交實驗結果Tab.5 L9（34）orthogonal results

表6 方差分析Tab.6 Variance analysis

2.2.4 追加實驗

通過以上正交實驗得到最佳固定化顆粒制備條件為A1B2C2D1，而在9組實驗中并不包含這一水平組合，因此按照A1B2C2D1的實驗條件做追加實驗.追加實驗條件下固定化小球對HPAM的降解率為83.1%，高于前9次實驗條件下的降解率.

3 結 論

1）利用海藻酸鈉－PVA混合載體固定法時，海藻酸鈉質量分數一般在2%～4%時固定化小球制作成型容易、速度快，凝膠的封閉性好.

2）海藻酸鈉－PVA混合載體中在海藻酸鈉的質量分數為4%，PVA的質量分數也為4%時，制得的固定化顆粒滲透性和強度好，且顆粒制備容易.

3）選定濕菌體與包埋劑體積比、硼酸質量分數、氯化鈣質量分數、交聯時間作為正交試驗的4個影響因素，考察固定化顆粒對HPAM降解率的影響.方差分析結果表明，固定化顆粒最佳制備條件是氯化鈣質量分數為2%和硼酸質量分數為3%、分階段交聯、在氯化鈣中交聯4h后轉入硼酸中交聯20h、濕菌體與包埋劑體積比為1∶1.固定化制備條件對聚丙烯酰胺降解率影響因素大小依次為：濕菌體與包埋劑體積比＞硼酸質量分數＞氯化鈣質量分數＞交聯時間.

4）按照最佳的固定化顆粒制備條件做追加實驗，實驗結果表明在此條件下混合菌固定化顆粒對HPAM降解率達到83.1%，高于前9次實驗條件下的降解率.

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