松質骨基質復合生物蛋白膠構建組織工程軟骨的研究

王正輝 常會敏 吳寶俊 楊壯群 KamalMustafa 盧曉云

松質骨基質復合生物蛋白膠構建組織工程軟骨的研究

王正輝 常會敏 吳寶俊 楊壯群 KamalMustafa 盧曉云

目的嘗試采用松質骨基質與生物蛋白膠復合材料構建組織工程軟骨。方法體外培養大鼠軟骨細胞，接種于松質骨基質/生物蛋白膠材料上行體外培養。采用HE、甲苯胺藍染色免疫學檢測、掃描電鏡觀察等方法觀察所構建的組織工程軟骨的特性。結果松質骨基質/生物蛋白膠組的組織學結構更接近于軟骨樣組織，其Ⅱ型膠原、蛋白多糖基因表達量及蛋白多糖含量明顯高于松質骨基質組。結論松質骨基質/生物蛋白膠復合材料可用于構建組織工程軟骨，是一種較理想的支架材料。

軟骨細胞組織工程生物蛋白膠支架材料

先天性畸形或后天獲得性疾病導致的軟骨組織缺損，如耳、鼻、氣管的缺損或畸形等，嚴重影響患者的顏面外觀或器官功能。軟骨是一種無血管的組織，自身修復能力有限。隨著組織工程學的發展，組織工程軟骨的構建為修復軟骨缺損開辟了一條新途徑。

在組織工程軟骨的構建中，大量生長狀態良好的軟骨細胞以及合適支架材料起著十分關鍵的作用。近年的研究表明，多種生物材料均可用于組織工程軟骨的構建，各種材料均有各自的優勢和缺點。松質骨基質（BMG）是具有良好的組織親和性和結合力的天然生物材料。但是，單純的松質骨基質對軟骨細胞的吸附力并不強，軟骨細胞不易附著，而且松質骨基質支架的孔隙大小不等，孔徑相對較大，軟骨細胞易丟失，不易形成軟骨組織。因此，本研究嘗試將BMG與生物蛋白膠復合，用于構建組織工程軟骨。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

高糖DMEM培養基、胰蛋白酶（Gibco公司）；透明質酸酶、Ⅱ型膠原酶（Sigma公司）；胎牛血清（Invitrogen公司）；Ⅱ型膠原一抗（小鼠抗大鼠，Neomarker公司）；Aggrecan單克隆抗體（羊抗大鼠，Santa Cruz公司）；殼聚糖/明膠（天津中醫藥大學）；BMG（第四軍醫大學骨科）；生物蛋白膠（廣州倍繡生物技術有限公司）；Real-time PCR mix(Toyoboco公司)；CO2培養箱（Thermo公司）；熒光顯微鏡（Nikon公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 SD大鼠肋軟骨細胞的培養[1]

SD大鼠頸椎脫臼法處死，無菌操作臺中取其肋軟骨組織，剝離軟骨膜，用眼科剪剪至1mm3左右的組織塊。采用三步法消化，獲得軟骨細胞，置于37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養。傳代培養采用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA（比例為1∶1）進行消化，25 cm2培養瓶接種，接種密度為1×105cells/mL。本實驗所采用的是第2代肋軟骨細胞，分別接種于松質骨基質/生物蛋白膠材料（BMG/生物蛋白膠組）與松質骨基質材料（BMG組）上進行體外培養。

1.2.2 BMG/生物蛋白膠-軟骨細胞復合物的構建

將松質骨基質浸泡于DMEM培養液中5 min后取出，用滅菌濾紙吸干附在松質骨基質表面和網眼內的水分，浸泡凝血酶后晾干。將纖維蛋白原主體膠與第1代軟骨細胞混合，制成1×107cells/mL的細胞懸液，向材料上滴入纖維蛋白原細胞懸液50μL，加入DMEM培養液200μL，置于培養箱內10min。將軟骨模塊全部移至24孔培養板中，加入2mL含20%胎牛血清的高糖DMEM培養液，置于5%CO2恒溫箱內培養，每天半量更換培養液，共培養8周。

1.2.3 組織學觀察

培養1周時取出組織塊，4%多聚甲醛固定，常規制作切片，行HE、甲苯胺藍染色，光鏡觀察。

1.2.4 免疫學檢測[2]

培養6周的組織塊以4%多聚甲醛固定，Triton室溫下浸泡25min，0.01M PBS洗3次，每次5min；滴加1滴3%H2O2，消除內源性過氧化物酶活性。0.01M PBS洗滌3次，每次3 min；滴加1滴工作用血清（試劑A），常溫孵育15min，以消除非特異性染色；分別滴加（1:200）Ⅱ型膠原（CollagenⅡ）單克隆抗體50μL，4℃冰箱過夜（＞18 h）；加入用免疫熒光染色二抗稀釋液稀釋熒光標記的二抗，培養箱內，孵育15 min；0.01 M PBS洗3次，每次5 min；避光，熒光顯微鏡觀察。

1.2.5 掃描電鏡觀察

培養2、4周的標本各1塊，2.5%戊二醛固定,梯度乙醇脫水，干燥，掃描電鏡觀察支架材料表面軟骨細胞的黏附和細胞的形態、結構。

1.2.6 Real-time PCR檢測CollagenⅡ及Agrecan mRNA含量[3]

6周時用Trizol常規提取組織塊RNA，CollagenⅡ引物序列:5’-AACACTGCCAACGTCCAGAT-3’/ 3’–CTGCAGCACGGTATAGGTGA-5’；Aggrecan引物序列:5’-GAGGTCGTGGTGAAAGGTGT-3’/3’–GTGTGGATGGGGTACCTGAC-5’；內參GAPDH序列:5’-AAATGGTGAAGGTCGGTGT G-3’/3’–GGTAGTTGCTGGGGAAGT-5’。具體操作根據試劑盒說明進行。

1.2.7 生物化學分析

6周時檢測構建的組織工程軟骨的GAG和羥脯氨酸的含量，以分別驗證A ggrecan和C ollagenⅡ的含量。采用Hoechst 33258染色法進行測量，以硫酸軟骨素制作標準曲線，二亞基亞甲藍分光比色法檢測GAG。采用L-羥脯氨酸制作標準曲線檢測羥脯氨酸的含量[4]。所有檢測均重復3次。

2 實驗結果

2.1 組織學觀察

構建的組織工程軟骨1周時HE染色顯示，軟骨細胞位于一個篩網結構中，彼此之間被相鄰的細胞胞外基質分開。BMG/生物蛋白膠組較BMG組表現出更好的軟骨樣組織特征。在BMG/生物蛋白膠組細胞外周和區間基質被甲苯胺藍染色深藍色證實了蛋白多糖的存在，而在BMG組甲苯胺藍染色呈淡藍色（圖1）。

2.2 免疫學和SEM觀察

6周時，Ⅱ型膠原免疫染色顯示，BMG/生物蛋白膠組中基質強染，而BMG組只有較淺的著色。電鏡觀察顯示，在BMG/生物蛋白膠組可觀察到篩網內密集的或者單個的軟骨細胞，細胞周圍有大量的基質。而BMG組只能觀察到少量的軟骨細胞（圖2）。

圖1 BMG/生物蛋白膠組與BMG組組織學觀察（100×，光鏡）Fig1 The histological observation of tissue in BMG/fibrin glue group and BMG group(100×,lightm icroscope)

2.3 生化分析和Real time PCR檢測

Real time PCR檢測顯示，BMG/生物蛋白膠組和BMG兩組的Ⅱ型膠原基因表達沒有顯著差異（P＞0.05）；而蛋白多糖的基因表達發現，BMG/生物蛋白膠組明顯高于BMG組（P＜0.05）。BMG/生物蛋白膠復合體和BMG組中mRNA的表達證實這兩種支架材料都具有維持軟骨細胞表型的能力（圖3）。生化分析結果顯示，與BMG組相比，BMG/生物蛋白膠組糖胺多糖、羥脯氨酸的水平顯著增加（P＜0.05），BMG組的羥脯氨酸含量只有BMG/生物蛋白膠組的36.5%（圖4）。

圖2 BMG/生物蛋白膠組與BMG組免疫組化染色（100×，熒光顯微鏡）和電鏡觀察（標尺：100μm）Fig2 The imm unological observation(100×,fluorescence m icroscope)and SEM observation(Scale:100μm)of tissue in BMG/fibrin glue group and BMG group

圖3 BMG/生物蛋白膠組與BMG組C olⅡ、A ggrecan基因表達量Fig.3 The expression of collagen II and aggrecan in BMG/fibrin glue group and BMG group

圖4 BMG/生物蛋白膠組與BMG組糖胺多糖和羥脯氨酸含量Fig.4 The glycosam inoglycan and hydroxyproline content in BMG/fibrin glue group and BMG group

3 討論

BMG是骨組織經過脫鈣、去脂、去蛋白等處理，去掉了除BMP以外95%非膠原蛋白和有阻滯作用的脂質成分，降低了抗原性[5-6]，同時松質骨基質還存留有少量BMP和其他促進骨軟骨形成的內在生長因子。但是，單純的BMG對軟骨細胞的吸附力并不強，軟骨細胞不易附著，容易丟失，不易形成軟骨組織。生物蛋白膠又稱為纖維蛋白封閉劑，可塑性強，生物相容性好，是組織工程軟骨構建可選擇的聚合物支架[7]。Lynn等[8]已經在實驗中證實，兔關節軟骨細胞能在人纖維蛋白凝膠中分裂增殖、合成基質并保持其表型。纖維蛋白膠存在降解速度過快的缺點[9]，我們嘗試將BMG/生物蛋白膠進行復合，以期能夠相互彌補缺陷，更為符合組織工程軟骨構建的要求。

我們發現，軟骨細胞與單純的BMG黏附性較差。軟骨細胞很容易從BMG支架材料上脫落，從而影響軟骨組織的形成。這種低黏附性可能是由于BMG相對較大的孔徑造成的。目前研究中，解決細胞低黏附性問題的方法就是用生物蛋白膠制備BMG/生物蛋白膠凝膠支架材料。本研究結果表明，與單純BMG材料比較，BMG/生物蛋白膠支架材料上的軟骨細胞能分泌更多特定的細胞外基質成分，在軟骨細胞之間形成大大小小的群集，維持了原代細胞的形態。另外，組織學證明，在BMG/生物蛋白膠上的軟骨細胞細胞外基質的沉積優于BMG組，可能是由于BMG/生物蛋白膠組的細胞接種率和接種均勻性較單純的BMG組好造成的。將生物蛋白膠復合后明顯促進了高質量的軟骨組織的形成[10]。

理想的適合軟骨組織工程的支架材料不僅能促進軟骨細胞的黏附與增殖，而且能維持軟骨細胞表型。眾所周知，在體外培養軟骨細胞時，尤其是在培養皿或者培養瓶中的單層培養系統，軟骨細胞容易去分化，從而失去分泌軟骨特有細胞外基質大分子（如Ⅱ型膠原蛋白和蛋白多糖）的能力，取而代之的是分泌Ⅰ型膠原。去分化后的軟骨細胞產生機械性能較差的纖維軟骨[11]。本研究中，透明軟骨的細胞外基質分子（Ⅱ型膠原蛋白和蛋白多糖）基因表達表明，在BMG/生物蛋白膠及BMG組都很好維持了軟骨細胞的表型。具有正常表型和功能的軟骨細胞中Ⅱ型膠原蛋白的含量很高、蛋白多糖的表達較高，這表明我們構建的軟骨樣組織，其軟骨細胞表型在培養的前6周得到很好的維持，說明這兩種支架材料都能支持軟骨細胞的生長和軟骨形成。

盡管BMG/生物蛋白膠和單純BMG組在組織學上并沒有明顯的差異，兩組的Ⅱ型膠原基因表達圖譜也沒有明顯差異。但是，兩組的蛋白多糖表達存在很大的不同。這種自相矛盾的檢測結果，可能是應為mRNA和蛋白質分析水平的差異。

[1]王正輝,賀西京,楊壯群,等.RNA干擾aggrecanase1表達對體外培養的軟骨細胞基質代謝的影響[J].南方醫科大學學報,29(9): 1766-1769.

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Construction Tissue-Engineered Cartilage Using Bone M atrix Gelatin and Biological Fibrin G lue

WANG Zhenghui1, CHANG Huim in1,WU Baojun1,YANG Zhuangqun2,Kamal Mustafa3,LU Xiaoyun4.
1 Department of Otolaryngology-Head &Neck Surgery,The Second Affiliated Hospital,Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710004,China;2 Department of Plastic and Burns Surgery,The First A ffiliated Hospital,Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710061,China;3 Faculty of Dentistry, University of Bergen,Norwa;4 Departmentof Biological Science and Bioengineering,School of Life Science and Technology, Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710049,China.Corresponding author:WU Baojun(E-mail:yzhqun@mail.xjtu.edu.cn).

Objective To explore the feasibility of the construction of tissue-engineered cartilage using hybrid scaffolds of demineralized bonematrix gelatin(BMG)and fibrin glue.M ethods Rattus chondrocytes were cultured on hybrid BMG/ fibrin glue scaffolds(BMG/fibrin glue group)and BMG scaffolds(BMG group)in vitro.Engineered cartilage-like tissue grown on the scaffolds was characterized by histological observation,immunological examination,scanning electron m icroscopy, biochemical assays and analysis of gene expression.Results The presence of proteoglycan was confirmed by positive toluidine blue in BMG/fibrin glue group,compared with BMG group.Collagen type II exhibited intense immuno-positivity at the peri-cellularmatrices in BMG/fibrin glue group,compared with BMG group.The expression of collagen typeⅡhad no significant difference between BMG/fibrin glue group and BMG group(P＞0.05),while the expression of aggrecan core protein in BMG/fibrin glue group was higher than that in BMG group(P＜0.05).The glycosaminoglycan production and hydroxyproline content of BMG/fibrin glue group were higher than that of BMG group(P＜0.05).Conclusion The fibrin/BMG hybrid scaffoldsmay serve as a potential cell delivery vehicle and a structural basis for cartilage tissue engineering.

Chondrocytes;Tissue-engineered cartilage;B iological fibrin glue;Scaffolds

Q813.1+2

A

1673－0364（2012）03－0126－04

2012年3月20日；

2012年4月14日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2012.03.002

國家自然科學基金資助項目（81000416）；中央高校基本科研業務費專項資金（西安交通大學國際合作類，交叉學科類）；西安交通大學第二附屬醫院人才培養基金。

710004陜西省西安市西安交通大學第二附屬醫院耳鼻喉-頭頸外科（王正輝，常會敏，吳寶俊）；710061陜西省西安市西安交通大學第一附屬醫院整形燒傷科（楊壯群）；挪威卑爾根大學牙科學院（Kamal Mustafa）；710049陜西省西安市西安交通大學生命科學與技術學院（盧曉云）。

吳寶俊（E-mail:yzhqun@mail.xjtu.edu.cn）。