不同來源成體干細胞及不同細胞系的微囊化包裹

張書紅 沈 陽 湯亭亭

不同來源成體干細胞及不同細胞系的微囊化包裹

張書紅 沈 陽 湯亭亭

目的研究不同來源的間充質干細胞以及不同的細胞系在微囊內的存活情況，為促進骨再生微囊化基因給藥平臺的建立提供實驗基礎。方法從大鼠骨髓、脂肪和滑膜中分離培養間充質干細胞（BMSCs、ADSCs和SMSCs），并培養C3H10T1/2、C2C12和NIH/3T3等細胞系，利用高壓靜電法制作包裹以上細胞的海藻酸-聚賴氨酸-海藻酸（APA）微囊，然后用EB/Calcein-AM染色方法測定細胞在微囊內1周及4周的存活情況。結果不同來源的間充質干細胞（BMSCs、ADSCs和SMSCs）以及C3H10T1/2、C2C12和NIH/3T3等細胞系在APA微囊內1周及4周的存活率均較高。結論不同來源的間充質干細胞（BMSCs、ADSCs和SMSCs）以及C3H10T1/2、C2C12和NIH/3T3等細胞系可在APA微囊內長期存活。

微囊間充質干細胞細胞系

在細胞治療和組織工程領域，目前研究和應用較多的細胞是間充質干細胞(MSCs)。MSCs廣泛分布于人體各種器官和組織，如骨髓、脂肪和滑膜中，具有取材方便、容易獲得等優勢。MSCs具有強大的自我更新能力和多向分化潛能，在不同的誘導條件下，可分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、肌細胞、肌腱細胞、內皮細胞、真皮細胞和神經細胞等。

MSCs雖然廣泛分布于人體各種器官和組織中，但研究最多的是骨髓來源的MSCs，其他如脂肪、滑膜來源的MSCs近年來也有廣泛報告。MSCs的分離、培養至今缺乏統一的方法。由于沒有可靠的特異性表面標志分子，不易應用流式細胞儀或免疫磁珠對其進行分選。目前MSCs的分離和培養通常采用貼壁培養法，但所得干細胞的特性和狀態不盡相同。

在前期研究中，我們已建立了骨髓來源間充質干細胞的微囊化包裹方法。本研究中，我們擬對骨髓、脂肪、滑膜等不同的來源MSCs，以及3種不同來源的細胞系：成纖維細胞系（C3H10T1/2）、成肌細胞系（C2C12）和前成骨細胞系（NIH/3T3）進行微囊包裹，并比較6種細胞在微囊內存活能力的差異，為進一步的基因轉染研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

海藻酸鈉（Sigma，美國）；聚賴氨酸（FLUKA，美國）；培養基α-MEM（GIBCO，美國）；Calcein-AM（Calbiochem，美國）。

高壓靜電場成囊裝置（上海理工大學研制，中國）；倒置相差顯微鏡（OLYMPUS，日本）；CO2培養箱（THERMO，美國）；液氮罐（CBS，美國）；臺式離心機（Eppendorf，德國）；電子分析天平（METTLER TOLEDO，瑞士）。

1.2 細胞培養

1.2.1 不同來源MSCs的分離與培養

分別取SD大鼠（中國科學院上海實驗動物中心提供）的骨髓間充質干細胞（BMSCs）、脂肪干細胞（ADSCs）和滑膜干細胞（SMSCs），用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的10 m LαMEM培養液培養，接種于10 cm培養皿中，置于37℃、5%CO2培養箱孵育。次日換液以除去死細胞，以后每隔2天換液。待細胞增殖達到80%～90%融合時，用0.05%胰蛋白酶/0.02%EDTA消化，1∶4傳代培養。

1.2.2 三種細胞系的來源和培養

成纖維細胞系（C3H10T1/2）、成肌細胞系（C2C12）和前成骨細胞系（NIH/3T3）均來源于中國科學院上海生命科學院細胞庫。C3H10T1/2與NIH/ 3T3用αMEM培養基培養，而C2C12用DMEM培養基培養。

1.3 細胞微囊的制備

參照文獻[1]的方法制備包裹干細胞的海藻酸-聚賴氨酸-海藻酸(APA)微囊。主要步驟如下：①將上述所得細胞懸液與一定濃度的海藻酸鈉溶液混合制成細胞懸液，細胞終濃度為3×106cells/mL，海藻酸鈉終濃度為1.75%；②置于電壓為3 KV、液面距25mm、推進速度30 mm/h的高壓靜電場成囊裝置中，將該混合液滴入100mmol/LCaCl2溶液中并反應10min，0.9%NaCl洗滌2次；③再與0.05%聚賴氨酸溶液反應使微粒外包裹一層聚賴氨酸并反應5 min后 0.9%NaCl洗滌2次；④加入0.15%海藻酸鈉溶液中和微粒表面電荷，0.9%NaCl洗滌2次；⑤最后用55 mmol/L檸檬酸鈉溶液置換出微粒核心中的鈣離子得到微囊，0.9%NaCl洗滌2次；⑥所得微囊置于無菌培養皿中，加入DMEM培養液10mL，于37℃、5%CO2培養箱中培養待用。

1.4 EB/Calcein-AM染色

將細胞微囊用PBS洗滌后，于96孔板中每孔加入100mg/L的EB溶液3μL（終濃度約8μmol/L）及50μmol/L的Calcein-AM溶液10μL（終濃度為5μmol/L）。孵育20min后，在熒光顯微鏡下觀察。Calcein-AM溶液配置步驟如下：①用DMSO配置1mmol/L的Calcein-AM（即在其中加入1mLDMSO-dimethylsulfoxide溶解）；②用PBS稀釋至1～50μmol/L，加入1/10培養基的量（100μL加入10μL）。細胞染色后用熒光顯微鏡觀察（激發波長490 nm，發射光512 nm）。注意事項：①Calcein-AM可能水解，因此水溶液需在1 d內使用，DMSO溶液-20℃保存；②在室溫下解凍，在打開前短暫離心，重新凍存前密封所有的儲存液；③在檢測前需將細胞洗滌以去除或稀釋血清酯酶活性（通常在血清培養基中存在，因血清酯酶可導致胞外熒光的升高）。

2 實驗結果

2.1 骨髓間充質干細胞生長情況

初接種的細胞種類較多，倒置顯微鏡下可見滿視野圓形且折光性較強的細胞，其中多數為紅細胞，不貼壁，3 d后半量換液，由于紅細胞減少，可見少量的貼壁細胞，呈棒狀或紡錘狀。7 d后全量換液，瓶內見多個細胞克隆形成，細胞多伸展為長梭形。10 d后，克隆增大與其他克隆逐漸融合。隨著換液次數的增加懸浮不貼壁的細胞逐漸被清除，少數夾雜生長。以后3 d換一次培養液。到第14天，貼壁細胞幾乎90%匯合（圖1A）。

2.2 脂肪干細胞的生長情況

脂肪組織經0.1%Ⅰ型膠原酶消化、紅細胞裂解液裂解后，可得到均一乳白色細胞。接種后5～7 h，部分細胞開始貼壁并開始伸出偽足，變為紡錘形或長梭形，24 h后細胞完全貼壁，細胞呈纖維樣細胞生長，48 h后，細胞開始增殖，3～5 d達到增殖高峰，呈集落樣生長，在6～8 d后達到80%左右融合。從第2代開始，細胞貼壁時間和增殖時間明顯加快，2 h內細胞均已貼壁，48 h后細胞可達到80～90%融合。經過多次傳代培養，細胞仍然保持旺盛的增殖能力和均一的成纖維細胞樣形態學特征（圖1B）。

2.3 滑膜干細胞的生長情況

原代SMSCs接種24 h后可見細胞貼壁，形態細長或為多角形，48 h后細胞數量增多，至72 h后便可見大量的紡錘形細胞，其中散在分布少許小圓形細胞。5 d左右可見細胞克隆形成（圖1C）。

2.4 三種細胞系的生長情況

C3H10T1/2，C2C12，NIH/3T3三種細胞系均具有繁殖快、生長密度大的特點，一般2～3 d即可長滿，當細胞密度達到80%～90%時，需傳代于新的培養瓶中，一般傳代比例為1∶3或1:4（圖2）。

2.5 微囊的制備

利用高壓靜電裝置制造的微囊，無論是包裹細胞的還是未包裹細胞的，微囊形態大小基本一致，直徑基本在200μm左右（圖3）。

2.6 微囊內細胞的存活

EB/Calcein-AM染色結果顯示，微囊內各種細胞在1周及4周的存活率都比較高，基本未看到死亡的細胞（圖4、5）。

圖1 不同來源成體干細胞的形態，均可見集落形成單位（標尺單位：20μm）Fig.1 Themorphology of different tissue derived adult stem cells with the appearance of colony form ing unit(Scale:20μm)

圖2 不同細胞系的生長形態（標尺單位：20μm）Fig.2 The m orphology of different cell lines(Sca le:20μm)

圖3 海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸鈉微囊的形態（標尺單位：100μm）Fig.3 Themorphology of alginate-poly-L-lysine-alginatem icrocapsules(Scale:100μm)

圖4 不同組織來源的干細胞微囊包裹1周和4周后的存活情況（綠色指示的是存活細胞，紅色指示的是死亡細胞；標尺單位：20μm）Fig.4 The viability of different tissue derived cells at 1 week or 4 weeks after encapsulation(The green fluorescence indicates live cells and the red fluorescence indicates dead cells;Scale:20μm)

圖5 不同細胞系在微囊包裹1周和4周后的存活情況（綠色指示的是存活細胞，紅色指示的是死亡細胞；標尺單位：20μm）Fig.5 The viability of d ifferent cell lines at 1 week or 4 weeks after encapsulation(The green fluorescence indicates live cells and the red fluorescence ind icates dead cells;Scale:20μm)

3 討論

Friedenstein等最早確認骨髓內含有的成纖維樣細胞具備多向分化潛能，可以分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞甚至是成肌細胞。他們將全骨髓放置在塑料的培養皿中，并且在4 h后去除非黏附的大部分造血細胞。這些細胞在經過數次傳代之后，在形態上更均一，更類似成纖維細胞。這些細胞因具有分化成不同種類的間充質細胞的能力，被稱為骨髓間充質干細胞（MSCs），又因被發現起源于骨髓內復雜的支持結構[2-6]，又被稱作骨髓基質細胞。MSCs和 MSCs樣細胞現在已經可以自骨髓外的多個部位分離得到，包括脂肪組織、羊水、滑膜、骨膜以及胚胎組織，其表型并不均一[7-11]。國際細胞治療學會（The International Society for Cellular Therapy，ISCT）已制定了表征MSCs的最主要標準，包括①在標準培養條件下貼壁生長的能力；②特定的表面分子表達，95%以上的細胞表達CD73、CD90（Thy-1）和CD105，不超過2%的細胞表達造血和內皮細胞的標志，即CD34、CD45、CD11b或CD14、CD19或CD79a等；③具備向骨、軟骨和脂肪至少三個方向上的分化能力[12]。

本研究中，我們使用了全骨髓培養法，利用骨髓間充質干細胞貼壁生長的特性來分離MSCs。全骨髓培養法是一種保留紅細胞和其他各種細胞混合培養的方法，該方法由于維持了BMSCs原始的生活環境，有利于BMSCs的分化，且操作過程也較為簡便。研究中觀察到原代培養的BMSCs呈集簇狀克隆生長，傳代后細胞貼壁迅速，生長增殖旺盛，約2～3 d便可傳代一次，短期內即可培養獲得大量細胞。脂肪干細胞也同樣生長迅速，短期內也能大量獲得。但是滑膜細胞的量較少，細胞獲取的時間比較長，這可能與大鼠滑膜組織較小有關。

為避免非自體干細胞可能引起的排異反應，本研究中嘗試利用微膠囊來包裹各種原代的干細胞和一些具備成骨分化潛能的細胞系。微囊表面有選擇性透過膜，可避免免疫系統對囊內細胞的攻擊，而小分子的營養物質和囊內生物活性物質及代謝產物可以自由出入，這樣保證了微囊內細胞的存活。在微囊的制備中，材料的選擇尤其重要。作為細胞移植的包封材料，一般要求具有優良的生物相容性，長期的生物與機械穩定性，一定的機械強度和良好的成膜性。細胞微囊幾乎均由水凝膠制備而成。這是一類可在水中膨脹但不溶解的合成或天然聚合物材料。作為制備細胞微囊的理想材料，水凝膠應該具有以下特性：①易于形成光滑透明的膠囊，可方便觀察膠囊內的細胞狀態；②組織周圍的機械或摩擦刺激可以通過凝膠柔軟圓滑的特性而消除；③由于材料的親水性，在流體和組織周圍無界面張力，這樣可將蛋白吸附和細胞黏附減小到最低限度，使微囊具有良好的生物相容性；④水凝膠對低分子量營養物和代謝物具有較高通透性；⑤材料通過聚電解質絡合原理在生理條件下成膜，反應條件溫和，有利于移植細胞的活性保存。其中以Lim等[13]的APA（海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸鈉）微囊制作方法在細胞移植中的應用最多。

包裹細胞的APA微囊是以海藻酸鈉為核心，周圍包裹陽離子聚合物材料聚賴氨酸，外面再包裹海藻酸鈉制成。它具有制備條件溫和、生物相容性好的特點，目前關于細胞微囊的研究中有超過85%的文獻應用了此種方法。與其他成囊方法相比，該方法所制得的微膠囊形狀規則呈球形、表面較光滑、均勻性較一致，特別適用于細胞的微囊化研究。2000年，李保國等[14]用高壓靜電法制作胰島細胞微膠囊取得成功。前期研究中，我們也嘗試用微囊來包裹骨髓MSCs并獲成功[1，15-16]。

據報道，微囊的大小與微囊內細胞的存活也有關系，較小的微囊更能減少免疫細胞對于微囊的排斥反應[17]。在將微囊植入體內時，由于血管釋放營養和氧氣的最大有效距離為200μm[18]，為了能確保微囊內的細胞獲得更多的營養和氧氣，縮短微囊與血管的距離顯得尤其重要，較小微囊內的細胞更能夠得到長期的存活。Robitaille等[19]發現微囊內細胞的死亡主要是由于營養不足，較大微囊(大于200μm)內細胞死亡更多。Sugiura等[20]認為微囊的直徑不要超過300～400μm。Zhang等[21]則認為微囊的直徑應在100μm左右，微囊內細胞的存活會更好。但微囊過小其內部能容納的細胞量也較少，本研究中制備的微囊大小直徑在200μm左右。研究結果證明，各種原代的干細胞與細胞系均可以在此APA微囊中長期存活。

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The Growth and Viability of Different Tissue Derived Mesenchymal Stem Cells and Different Cell Lines in Microcapsules

ZHANG Shuhong,SHEN Yang,TANG Tingting.
Shanghai Key Laboratory of Orthopaedic Implant, Department of Orthopaedics,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:TANG Tingting(E-mail：tingtingtang@hotmail.com).

Objective To observe the growth and viability of different tissue derived mesenchymal stem cells and different cell lines in microcapsules and to provide the experimental basis for the establishment of the m icroencapsulated gene medicine strategy.Methods The bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs),adipose-derived stem cells(ADSCs), synovium-derived mesenchymal stem cells(SMSCs)were isolated from rat.These cells,along with the C3H10T1/2 cell lines, C2C12 cell lines and NIH/3T3 cell lines,had been encapsulated in the alginate-poly-L-lysine-alginate(APA)microcapsules producing by high voltage electrostatic generator.The viability of cells in APA m icrocapsules were determ ined by EB/ Calcein-AM dyeing method.Results The survival rates of different tissue derived mesenchymal stem cells including the BMSCs,ADSCs and SMSCs,as well as the C3H10T1/2 cell lines,C2C12 cell lines and NIH/3T3 cell lines were high at 1 week and 4 weeks after encapsulation.Conclusion Different tissue derived mesenchymal stem cells including the BMSCs, ADSCs and SMSCs,as well as the C3H10T1/2 cell lines,C2C12 cell lines and NIH/3T3 cell lines could survive for a long time after encapsulation.

Microcapsules;Mesenchymal stem cells;Cell lines

Q813.1+1

A

1673－0364（2012）03－0130－06

2012年4月5日；

2012年4月21日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2012.03.003

國家自然科學基金（30772183、81172549）；上海高校創新團隊（第一期）發展計劃；上海市教委重點學科建設（J50206）。

200011上海市上海市骨科內植物重點實驗室，上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院骨科。

湯亭亭（E-mail：tingtingtang@hotmail.com）。