微生物濁度法與管碟法測定乙酰麥迪霉素制劑的效價Δ

王淑娟，高燕霞，程桂茹（.長春工業大學，長春3002；2.河北省藥品檢驗所，石家莊0500）

麥迪霉素為一組16元環大環內酯類抗生素的混合物，是日本的Takashi公司1971年從日本土壤中分離出來的生米加鏈霉菌（Streptomyces mycarofaciens）ATCC 21454經發酵提取分離制得的。其抗菌作用稍低于紅霉素，臨床主要用于革蘭陽性菌感染。乙酰麥迪霉素為麥迪霉素的2個位點上的羥基經乙酰化所得的一種二乙酰化合物，對革蘭陽性球菌有較強的抗菌活性，口服吸收良好，血藥濃度高，無苦味，具有很好的制劑學優點。乙酰麥迪霉素的體外活性與麥迪霉素基本相同，但體內活性卻顯著優于麥迪霉素，原因之一可能是由于分子結構中增加了2個乙酰基，使其脫酰化代謝變緩、體內濃度增加所致。

目前，乙酰麥迪霉素采用管碟法測定其含量[1～3]。管碟法能直觀反映樣品的體外抗菌能力，尤其對于單純化學方法難以分開的多組分抗生素來說，一直被廣泛應用。但同時因其操作煩瑣、影響因素多，而使結果的準確性有待商榷。采用濁度法測定則可克服上述不足之處[4，5]。筆者建立了以濁度法測定乙酰麥迪霉素制劑效價的方法，并與管碟法比較。通過對乙酰麥迪霉素用濁度法測定其效價的研究，可以進一步提高產品效價測定的準確性，有效地減少了誤差。同時，濁度法作為效價檢測的方法，不但可反映抗菌能力的高低，且具有更直觀的效果。

1 儀器與試藥

WBS-100全自動微生物比濁法測定儀、石英培養杯（厚度2 cm）（北京先驅威鋒技術開發公司）；CBZ-1抗生素光度比濁法測量儀、石英培養杯（厚度1 cm）（北京潮聲公司）；CAM-ⅢA智能抑菌圈測定儀（上海波浦新材料技術有限公司）。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]、乙酰麥迪霉素標準品（批號:130362-200301，純度:998 u·mg－1）均由中國食品藥品檢定研究院提供；乙酰麥迪霉素片（石藥集團歐意藥業有限公司，批號:114080401、6114090201，規格:每片0.1 g（10萬u））；乙酰麥迪霉素干混懸劑（沈陽第一制藥廠，批號:080308，規格:0.1 g∶0.5 g，1萬u）；抗生素檢定培養基Ⅲ號（pH7.0，批號:080501）、抗生素檢定培養基Ⅷ號（批號:080301）均由北京三藥科技開發公司提供，中國食品藥品檢定研究院監制；滅菌0.9%氯化鈉溶液和磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH4.5）均按《中國藥典》2010年版二部附錄[6]制備。

2 方法與結果

2.1 管碟法[1～3]

2.1.1 菌液的制備。

取枯草芽孢桿菌的試驗菌液[6]0.2 mL加至培養基Ⅷ號（另加0.3%酵母浸出粉，調節pH值使滅菌后為7.8～8.0）100 mL中，搖勻，為實驗菌液。

2.1.2 溶液的制備。

（1）標準品溶液。取乙酰麥迪霉素標準品適量，精密稱定，加乙醇溶解并稀釋成500 u·mL－1的溶液，作為儲備液備用；精密量取儲備液適量，用PBS進一步稀釋成20、40 u·mL－1的標準品溶液。

（2）供試品溶液。取乙酰麥迪霉素片10片，研細，精密稱取適量，加乙醇適量，充分振搖使溶解，再用乙醇稀釋制成500 u·mL－1的溶液，靜置，作為儲備液備用；精密量取儲備液適量，用PBS進一步稀釋成20、40 u·mL－1的供試品溶液a。取乙酰麥迪霉素干混懸劑20包，混合均勻，精密稱取適量，加乙醇適量，充分振搖使溶解，再用乙醇稀釋制成500 u·mL－1的溶液，靜置，作為儲備液備用；精密量取儲備液適量，用PBS進一步稀釋成20、40 u·mL－1的供試品溶液b。

2.1.3 培養與測定。

按照管碟法二劑量法進行試驗。在抑菌圈電腦測量分析儀上測量并計算結果，即得乙酰麥迪霉素片及干混懸劑的含量。

2.2 濁度法[6]

2.2.1 試驗菌、培養基及加菌量的選擇。

乙酰麥迪霉素為廣譜抗生素，對革蘭陽性菌及陰性菌均有很好的抗菌作用，同時選擇金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌為試驗菌，培養基為抗生素檢定培養基Ⅲ號。

在WBS-100全自動微生物比濁法測定儀上，選擇肺炎克雷伯菌為試驗菌，加菌量為2.5%，抗生素濃度為3.0、4.5、6.0、7.5、9.0 u·mL－1；測定后繪制乙酰麥迪霉素不同濃度及陽性對照的時間-吸光度曲線（生長曲線），詳見圖1。

圖1 肺炎克雷伯菌為試驗菌時乙酰麥迪霉素的生長曲線Fig 1 Growth curves of acetyl midecamycin with K.peumoniae as test organism

在CBZ-1抗生素光度比濁法測量儀上，選擇金黃色葡萄球菌為試驗菌，加菌量為1.2%，抗生素濃度為0.3、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 u·mL－1；測定后繪制乙酰麥迪霉素不同濃度及陽性對照的時間-吸光度曲線（生長曲線），詳見圖2。

對比圖1、圖2可知，采用肺炎克雷伯菌作為試驗菌，乙酰麥迪霉素的抗菌濃度范圍較窄，到達平臺期較早（180 min，3 h左右），曲線斜率較小，乙酰麥迪霉素的濃度較金黃色葡萄球菌時為高，這些都說明乙酰麥迪霉素對金黃色葡萄球菌更為敏感，所以最終采用金黃色葡萄球菌作為本實驗的菌種。

圖2 金黃色葡萄球菌為試驗菌時乙酰麥迪霉素的生長曲線Fig 2 Growth curves of acetyl midecamycin with S.aureus as test organism

2.2.2 一劑量法。

（1）菌液的制備。取金黃色葡萄球菌的營養瓊脂斜面培養物，接種于營養瓊脂斜面上，在35～37℃培養20～22 h，臨用時，用0.9%滅菌氯化鈉溶液洗下；取新鮮的菌懸液適量，加12%甲醛液1 mL殺滅，以生理鹽水稀釋，使得其在530 nm波長處的吸光值為1.0，記錄其稀釋所用的生理鹽水的毫升數和1 mL12%甲醛液的總毫升數，再將原菌液按此比例稀釋，即為試驗菌液。取試驗菌液1.2～2.5 mL加至培養基100 mL中，搖勻，為實驗菌液。

（2）溶液的制備。①標準品溶液:精密量取標準品儲備液適量，用PBS進一步稀釋成0.3、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 u·mL－1的標準品溶液。②供試品溶液c:精密量取供試品儲備液a適量，用PBS進一步稀釋成1.5 u·mL－1的供試品溶液。③供試品溶液d:精密量取供試品儲備液b適量，用PBS進一步稀釋成1.5 u·mL－1的供試品溶液。

（3）培養與測定。取標準品溶液及供試品溶液c各1.0 mL，加入滅菌培養管中，再加入實驗菌液9.0 mL，置于抗生素光度比濁法測量儀內，于37℃培養；另取PBS 1.0 mL，加9.0 mL空白培養基，混勻，作為空白對照。儀器在線于530 nm波長處測定各管金黃色葡萄球菌對數生長期內不同培養時間（實時記錄，從0開始到5 h左右）下的吸光度值，根據量反應平行線原理計算供試品的效價值。同法測定供試品溶液d。

2.2.3 二劑量法。

（1）溶液的制備。①標準品溶液:精密量取標準品儲備液適量，用PBS進一步稀釋成1.0、2.0 u·mL－1的標準品溶液；②供試品溶液e:精密量取供試品儲備液a適量，用PBS進一步稀釋成1.0、2.0 u·mL－1的供試品溶液；③供試品溶液f:精密量取供試品儲備液b適量，用PBS進一步稀釋成1.0、2.0 u·mL－1的供試品溶液。（2）菌液的制備、培養與測定均同一劑量法相關操作。

2.2.4 線性范圍的測定。

照抗生素微生物檢定一劑量法測定，并按“2.2.2”項下各組濃度標準品溶液所制菌液吸光度的值（y）對溶液對數濃度（x）進行線性回歸，繪制標準曲線，計算回歸方程及相關系數為y＝－4.048 8×10－1x+5.670 7×10－1（r＝0.998 3）。結果表明，采用標準品溶液進行一劑量法試驗，乙酰麥迪霉素檢測濃度線性范圍為0.3～3.0 u·mL－1。

2.2.5 回收率試驗。

精密稱取乙酰麥迪霉素標準品及已知含量的片劑樣品和干混懸劑樣品，按“2.2.3”項下方法制備各濃度的標準品溶液和供試品溶液a和供試品溶液b的儲備液，得3種溶液濃度均為400、500、600 u·mL－1的溶液，備用；分別等量精密量取標準品溶液和供試品溶液a和b儲備液適量，用PBS稀釋制成0.8和1.6 u·mL－1、1.0和2.0 u·mL－1、1.2和2.4 u·mL－1的供試品溶液（分別代表80%、100%和120%3種水平，每種溶液的終溶液再稀釋為2種濃度共6個溶液，進行二劑量法的測定）于儀器上測定，計算回收率。結果，片劑平均回收率為101.99%，RSD＝1.9%（n＝9）；干混懸劑平均回收率為101.68%，RSD＝1.68%（n＝9），詳見表1。

表1 加樣回收試驗測定結果（n＝9）Tab 1 Results of recovery test（n＝9）

2.2.6 適用性考察。

將乙酰麥迪霉素制劑按“2.2.3”項下方法制備成供試品貯備液及供試品溶液，分別在冰箱保存5、2 d，每天照“2.2.3”項下方法進行測定，并計算當天效價。結果，供試品貯備液和供試品溶液的效價的RSD均小于1.5%，表明乙酰麥迪霉素制劑的貯備溶液和進樣用測定溶液分別在冰箱保持5 d和2 d內穩定，完全滿足試驗需要。

2.2.7 樣品效價測定。

取乙酰麥迪霉素制劑共3批，按“2.2.3”項下方法進行測定。并將結果與原方法（即管碟法）進行比較。結果表明，本方法結果與管碟法結果無顯著性差異，具體見表2。

表2 2種方法效價測定結果比較Tab 2 Comparison of antimicrobial activity of two methods

2.2.8 2種方法的數據檢驗。

采用成對觀測的t檢驗[7]，由表2可計算出3批制劑的2種方法效價差值d的平均值為－0.9%，標準偏差s為－1.058 3%，需要的檢驗統計量t為:

當自由度為2、水平為5%的│t│的臨界值是4.303，由于1.473＜4.303，因而可認為2種方法的效價測定結果基本一致，2種方法均可控制藥品質量。

3 討論

乙酰麥迪霉素采用管碟法測定效價時，抗生素檢測濃度線性范圍均為5～40 u·mL－1[1，2]，本文采用濁度法測定效價時，抗生素線性范圍為0.3～3.0 u·mL－1，說明采用濁定法具有更低的檢測限、更高的靈敏度，表現更直觀。本文所建立的濁度法，通過“2.2.1”項下的比對結果，采用更為敏感的金黃色葡萄球菌作為試驗用菌，不僅方法更靈敏，可信限率也大大降低；而方法可靠性增加后，必然會使結果的準確性得以提高。

由于乙酰麥迪霉素為16元環大環內酯類抗生素，是由A1、A2～A4、柱晶白霉素A6等組分組成的混合物，受發酵菌種和生產工藝的影響，各組分含量比例變化不定。所以在化學方法越來越占分析主流的今天，多組分抗生素仍采用生物測定法進行含量測定。但采用管碟法測定效價時，受擴散系數、培養基黏稠度、抑菌圈大小等諸多因素影響，因此測定誤差較大。濁度法測定在液體培養基中進行，可避免上述因素的影響；用固定波長測定菌液的吸光度，精密度優于管碟法中對抑菌圈的測定，且培養時間短，因此測定更為快速、準確。

現行標準采用管碟法測定乙酰麥迪霉素制劑的效價時，樣品制備時貯備液幾乎都是采用乙醇進行溶解，到終溶液時用緩沖液來稀釋，這樣終溶液中乙醇的濃度達到了8%。因為該方法是現行方法，所以筆者未對該方法進行修改。同時，為便于比較管碟法和濁度法，筆者沿用了標準中溶液制備的方法。

經濁度法與管碟法測定效價比較結果表明，濁度法測定乙酰麥迪霉素制劑效價的方法準確、可靠、快捷，并具有更低的檢測限、更直觀的效果。本方法作為乙酰麥迪霉素制劑效價測定的質控方法值得推廣，可與管碟法并存。

[1]WS1-（X-352）-2003Z，乙酰麥迪霉素[S].2004.

[2]WS1-（X-320）-2003Z，乙酰麥迪霉素片[S].2004.

[3]WS1-（X-254）-2003Z，乙酰麥迪霉素干混懸劑[S].2004.

[4]王金龍，高燕霞.濁度法測定四環素的效價[J].藥物分析雜志，2007，27（12）:1 988.

[5]高燕霞，王茉莉.交沙霉素及其片劑效價的比濁法測定[J].中國醫藥工業雜志，2008，39（2）:123.

[6]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[S].2010年版.北京:中國醫藥科技出版社，2010:附錄93、附錄95.

[7]羅 旭.化學統計學[M].北京:科學出版社，2001:120-121.