醛固酮受體拮抗劑對心肌細胞凋亡的影響

許香梅 任曉敏 劉曙光 劉海云 王曉燕 董士民

心肌細胞凋亡是急性心肌梗死后心室重構的重要因素，醛固酮可通過多種途徑引起細胞凋亡，參與心室重構［1］。而細胞凋亡調控基因最受關注是Bcl-2家族，Bcl-2、Bax基因是Bcl-2家族的成員，為心肌細胞凋亡相關基因［2］，本研究旨在評價醛固酮受體拮抗劑螺內酯對急性心肌梗死后心肌細胞凋亡率、Bcl-2蛋白、Bax蛋白表達的影響，探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與方法 通過結扎左冠狀動脈前降支造成大鼠左室大面積心肌梗死。將術后2 d存活的大鼠72只隨機分為假手術組(Sham組n=24)和心肌梗死組(n=48)。心肌梗死組隨機分為:AMI對照組(AMI組，0.9%氯化鈉溶液 2 ml·d－1灌胃，n=24)和螺內酯組(Spi組，螺內酯 20 mg·kg－1·d－1灌胃，n=24)。3個組分別于術后的2、7、14、21 d取材，用于流式細胞學檢測。用3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，迅速開胸，取出心臟，冰上操作，4℃經高壓處理的二氧哌嗪甲酰氯(DEPC)水中洗去殘余血液，剪取左室非梗死區心肌組織約100 mg，放入75%的乙醇中保存用于流式細胞學檢測。

1.2 大鼠急性心肌梗死模型制作 大鼠稱重，經3%戊巴比妥鈉麻醉(40 mg/kg腹腔內注射)，并給予阿托品0.1 mg/kg腹腔注射。作氣管插管，接小動物呼吸機(由江西省特力麻醉呼吸設備公司生產)。取前胸正中切口，在3～4肋間進入胸腔，分離心包，從劍突下方向胸腔方向及從兩側胸壁后方向上方適度擠壓，使心臟跳出胸腔，在右室流出道與左心房之間，距主動脈根部2～3 mm處用絲線(7-0)穿過左冠狀動脈前降支，在心肌梗死組連同一小束心肌一起結扎，以心臟表面顏色即刻變化，術后心電圖J點抬高判斷造模成功。然后逐層關胸。撤掉呼吸機，自主呼吸平穩后，拔出氣管插管，逐層縫合。假手術組(Sham組)只穿線繞過冠狀動脈前降支而不結扎。術后大鼠保溫，單籠放置，待清醒后再次稱重，編號，按組分籠飼養。

1.3 觀察指標 流式細胞方法測定細胞凋亡率及BCL-2、Bax基因蛋白表達:取以上制備好的單細胞懸液，通過間接熒光法進行標記。先分別加入兔抗鼠Bcl-2、Bax蛋白抗體，室溫孵育30 min，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)10 ml洗滌1次，棄去上清，加入羊抗鼠FITC-IgG二抗工作液100 μl，避光室溫孵育30 min，加入PBS 10 ml離心同上，棄上清以除去未結合的熒光二抗，上機檢測前加入PBS 0.1 ml經500目銅網過濾后上機檢測。同時以PBS代替一抗作為陰性對照，用流式細胞儀測定樣品中Bcl-2、Bax蛋白，將采集的數據輸入計算機進行處理，以熒光指數(fluorescence index，FI)表示蛋白的相對含量。FI=(樣品的平均熒光強度－對照樣品的平均熒光強度/正常組織平均熒光強度－對照樣品的平均熒光強度)。

1.4 統計學分析應用SPSS 13.3統計軟件，計量資料以表示，多組間采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 螺內酯對大鼠非梗死區心肌細胞凋亡的影響 流式細胞檢測結果:與Sham組相比較，AMI組和Spi組大鼠非梗死區心肌細胞凋亡率在2、7、14、21 d均顯著升高(P＜0.01);與 AMI組比較，Spi組大鼠非梗死區心肌細胞凋亡率14、21 d有所降低(P＜0.05)。見表1。

表1 3組大鼠非梗死區心肌細胞凋亡率變化n=6，%，±s

表1 3組大鼠非梗死區心肌細胞凋亡率變化n=6，%，±s

注:與 Sham 組比較，*P ＜0.01;與 AMI組比較，#P ＜0.05，△P ＜0.01

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2.2 螺內酯對大鼠非梗死區心肌細胞BCL-2、Bax蛋白表達的影響 與Sham組相比較，AMI組大鼠非梗死區心肌細胞BCL-2蛋白表達在2、7、14、21 d 均顯著降低(P＜0.01)，Bax蛋白表達在2、7、14、21 d 均顯著升高(P＜0.01);與 AMI組比較，Spi組大鼠非梗死區心肌細胞BCL-2蛋白表達在2、7 d差異無統計學意義(P＞0.05)，14、21 d均有所升高差異無統計學意義(P＞0.05);Bax蛋白表達在2、7 d差異無統計學意義(P＞0.05)，14、21 d 均有所降低(P＜0.05)。見表2、3。

表2 3組大鼠非梗死區心肌細胞BCL-2蛋白表達n=6，±s

表2 3組大鼠非梗死區心肌細胞BCL-2蛋白表達n=6，±s

注:與假手術組比較，*P ＜0.05，#P ＜0.01;與 AMI組比較，△P ＜0.05，☆P ＜0.01

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表3大鼠非梗死區心肌細胞Bax蛋白表達n=6，±s

表3大鼠非梗死區心肌細胞Bax蛋白表達n=6，±s

注:與假手術組比較，*P ＜0.01;與 AMI組比較，#P ＜0.05，△P ＜0.01

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3 討論

急性心肌梗死后心肌細胞凋亡在梗死區和非梗死區均存在，是急性心肌梗死后心室重構的重要因素［2，3］。細胞凋亡是受多種基因調控的程序性死亡，為凋亡信號通路的啟動和相關基因的表達，其中Bcl-2基因家族的作用尤為重要。其中重要成員Bcl-2基因目前被認為是最重要的抑制細胞凋亡的基因。在急性心肌梗死后非梗死區Bcl-2蛋白表達明顯下降同時Bax蛋白表達明顯升高，從而增加心肌細胞凋亡［4］。

本實驗顯示:大鼠急性心肌梗死后在AMI組2、7、14、21 d心肌細胞凋亡率顯著升高，而非梗死區Bcl-2蛋白表達均明顯降低，與研究報道［3］一致。提示AMI后心肌細胞凋亡與其Bcl-2蛋白表達呈相反趨勢，Bcl-2蛋白的表達抑制AMI后心肌細胞凋亡。一般認為Bcl-2蛋白可以和Bax蛋白結合，形成異源二聚體終止凋亡［5］。Bcl-2蛋白還可通過改變細胞內細胞器的Ca2+流而抑制凋亡［6］。Bax蛋白的表達在大鼠心肌梗死后AMI組 48 h、7 d、14 d、21 d 表達明顯增加，這與文獻［7，8］一致，提示Bax蛋白的高表達可以促進心肌細胞的凋亡。Bax基因是Bcl-2家族的另一重要成員，與Bcl-2作用相反，促進細胞凋亡。有實驗表明冠心病猝死者心肌細胞凋亡數與其Bax蛋白表達的陽性細胞數呈明顯正相關［9］。Bax基因可能是通過下調Bcl-2基因，升高細胞內Ca2+誘發細胞凋亡［10］。

本實驗顯示:Spi組對大鼠急性心肌梗死非梗死區心肌細胞BCL-2蛋白表達隨時間延長逐漸升高，分別升高6.3%、17%;心肌細胞凋亡率及Bax蛋白表達逐漸降低。提示螺內酯可能通過增加Bcl-2蛋白表達，減弱Bax蛋白表達，提高Bcl-2/Bax蛋白比率，而抑制心肌細胞凋亡，改善急性心肌梗死后心室重構。目前研究顯示引起細胞凋亡機制，可能與炎性細胞的激活、氧化應激損傷、Ca2+穩態失衡、細胞因子與黏附因子的表達、線粒體損傷有關。螺內酯是醛固酮受體拮抗劑，其抑制心肌細胞凋亡機制可能與下列因素有關:通過降低醛固酮水平，減弱相關轉錄因子的表達;通過減弱AMI后氧化應激，減輕氧化負荷;抑制炎性介質的表達，如TNF-α的表達;影響Ca2+的內流等機制，抑制細胞凋亡，增加Bcl-2表達，減弱Bax的表達，達到改善心室重構的作用。

急性心肌梗死后，非梗死區心肌細胞凋亡及Bax蛋白的表達增加，Bcl-2蛋白的表達降低;螺內酯治療可增加大鼠急性心肌梗死非梗死區Bcl-2蛋白的表達和減弱細胞凋亡及Bax蛋白的表達。

1 馮其茂，楊祖福.心肌細胞壞死和凋亡與心肌梗死后心室重構.中國康復理論與實踐，2007，13:59-60.

2 Akyurek LM，Johnsson C，Lange D，et al.Tolerance induction ameliorates allograft vasculopathy in rat aortictransplants.Influence of Fas-mediated apoptosis.J Clin Invest，1998，101:2889-2899.

3 Kajstura J，Cheng W，Reiss K，et al.Apoptotic and necrotic myocyte cell deaths are independent contributing variables of infarct size in rats.Lab Invest，1996，74:86-107.

4 馬中富，葉任高，羅斌，等.P53和Bcl22基因mRNA在老年急性心肌梗死猝死者心肌細胞凋亡中作用的研究.中國危重病急救醫學，2001，13:593-597.

5 Otter I，Conus S，Ravn U，et al.The binding protein properties and biological activities of Bcl22 and Bax in cells exposed to apoptotic stimuli.J Biol Chem，1998，273:6110-6120.

6 Lam M，Dubyak G，Chen L，et al.Evidence that Bcl-2 represses apoptosis by regulating endoplasmic reticulum associated Ca fluxes.Proc Natl Acad Sci USA，1994，91:6569-6573.

7 Misao J，Hayakawa Y，Ohno M，et al.Expression of Bcl-2 protein，an inhibitor of apoptosis，and Bax，an accelerator of apoptosis，in ventricular myocytes of human hearts with myocardial infarction.Circulation，1996，94:1506-1512.

8 Cheng W，Kajstura J，Nitahara JA，et al.Programmed myocyta cell death aftects the risble myocardium after infarction in rats.EXP Cell Res，1996，226:316-327.

9 陳躍峰，楊躍進，阮英茆，等.大鼠急性心肌梗死后心肌細胞凋亡和半胱天冬蛋白酶23的表達及卡維地洛的防治作用.中國循環雜志，2004，19:454.

10 Krown KA，Page MT，Nguyen C，et al.Tumor necrosis factor alpha-induced apoptosis in cardiac myocytes.Involvement of the sphingolipid signaling Cascade in cardiac cell death.J Clin Invest，1996，98:2854-2865.