Pim-3在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義探討

倪志強 方艷秋 譚巖

近年來，腫瘤的發生率明顯增高，嚴重影響人們的生命安全和生活質量。雖然腫瘤的治療方法不斷提高，但其病死率仍然居高不下。非小細胞肺癌化療敏感性較小細胞肺癌差，且發現時多為晚期，患者的預后較差，故尋找有效的靶向治療具有重要的臨床意義。Pim家族是一組參與鈣調節的相關蛋白激酶，Pim蛋白具有抗凋亡的作用，Pim-3作為Pim家族的新成員，已有基礎研究證實其與肺癌A549細胞的凋亡明顯相關[1]，但Pim-3與臨床非小細胞肺癌的相關性未見報道，故筆者對Pim-3在非小細胞肺癌中的表達及其臨床意義進行探討，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2010年1月～2012年5月的非小細胞肺癌標本40例（男26例，女性14例），年齡37～78歲，平均65歲。所有患者手術前均未接受放療、化療、生物治療或其他抗腫瘤治療；其中腺癌17例，鱗癌23例；分化程度：I級11例，II級9例，III級10例，IV級10例；有淋巴結轉移者25例，無淋巴結轉移者15例。選擇我院同期因肺膿腫或肺外傷手術患者40例的正常肺組織作為正常對照組。

1.2 免疫組化法檢測肺組織Pim-3蛋白的陽性表達 石蠟切片脫蠟至水；3%H2O2室溫孵育5～10min，以消除內源性過氧化物酶的活性；蒸餾水沖洗，PBS浸泡5min×2次；5%～10%正常山羊血清（PBS稀釋）封閉，室溫孵育10min，傾去血清，勿洗；滴加一抗工作液，37℃孵育1～2h或4℃過夜；PBS沖洗，5min×3次；滴加適量生物素標記二抗工作液，37℃孵育10～30min；PBS沖洗，5min×3次；滴加適量的辣根酶或堿性磷酸酶標記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育10～30min；PBS沖洗，5min×3次；顯色劑顯色3～15min（DAB）；自來水充分沖洗、復染、脫水、透明、封片。細胞質和細胞膜上的棕黃色顆粒為Pim-3陽性表達，光學顯微鏡下計數陽性細胞占所有細胞的百分比。

1.3 流式細胞術檢測肺組織中凋亡細胞百分比 手術標本分離單細胞懸液，經Annexin V與核酸染料標記后采用流式細胞儀測定肺組織中細胞凋亡率。具體步驟：取Falcon試管，按標本順序編好陰性對照管和標本管號。使用冷的PBS緩沖液洗細胞2次，再用1×Binding Buffer緩沖液制成1×106/mL的懸液。Falcon試管中加入100μ L細胞懸液。按體積加入Annexin V與核酸染料。輕輕混勻，室溫（20℃～25℃）避光處放置15min。各實驗管中分別加入1×Binding Buffer緩沖液400μL。1h內上流式細胞儀測定結果。

1.4 Pim-3陽性表達與肺癌臨床病理特征的相關性 比較不同臨床病理特征肺癌組織中的Pim-3的陽性率，判斷Pim-3陽性表達與肺癌臨床病理特征的相關性。

1.5 統計學方法 所有數據采用SPSS13.0統計學軟件進行處理，正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間差異性比較采用t檢驗，計數資料以百分比表示，組間差異性比較采用χ2檢驗，P＜0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同肺組織中Pim-3的陽性率 非小細胞肺癌組織中Pim-3的陽性率高達87.5%（35/40），明顯高于正常肺組織中Pim-3的陽性率5%(2/40)，P＜0.05。

2.2 不同肺組織中細胞凋亡率 非小細胞肺癌組織中細胞凋亡率明顯低于正常肺組織（22% vs 55.8%，P＜0.05）。

2.3 Pim-3陽性表達與非小細胞肺癌臨床病理特征的相關性 Pim-3的陽性表達與非小細胞肺癌患者的性別（男性87.3%，女性86.9%）、年齡（≥60歲患者85.0%，＜60歲者88.4%）、腫瘤大小（≥3cm 88.1%，＜3cm 83.2%）、腫瘤病理類型（腺癌89.2%，鱗癌85.4%）無關，與腫瘤分化程度（I+II期56.5%，III+IV期90.2%）和淋巴結轉移密切（無淋巴結轉移組43.9%，有淋巴結轉移組91.6%）相關。

3 討論

Pim-3基因位于人類染色體22q13，為35 600 bp長度[2]，其mRNA表達于大腦、心臟、腎臟、脾臟、胎盤、骨骼肌及外周血白細胞，在結腸、胸腺、肝臟及小腸正常組織中不表達[3]。目前研究表明，Pim-3可能通過以下途徑發揮生物學作用：(1)調控Bcl-2家族的抗凋亡蛋白或抑制凋亡基因Bad和G6-1，抑制細胞凋亡；(2)激活CDC25A，促進細胞的G1進程，抑制C-TAK1的活性，促進G2/M的轉換；(3)激活STAT-3信號途徑，促進G2/M進程；(4)抑制磷酸酶活性，阻止細胞凋亡[4]。本文采用免疫組化方法檢測了非小細胞肺癌組織和正常肺組織中Pim-3的陽性率，結果顯示非小細胞肺癌組織中Pim-3陽性率明顯增高，提示Pim-3的過表達參與了非小細胞肺癌的發生和發展。進一步凋亡率檢測結果提示，肺癌組織中的細胞凋亡率明顯低于正常肺組織，說明Pim-3通過調控細胞的凋亡率參與肺癌的發生發展，與上述研究結果相似。同時，本文對Pim-3陽性率與肺癌的臨床病理特征進行了進一步的分析，結果顯示Pim-3陽性率與患者性別、年齡、病理類型無關，而與腫瘤分化程度及淋巴轉移密切相關，證實Pim-3的生物活性與細胞的凋亡密切相關，其具體機制有待進一步研究。

綜上所述，Pim-3可以成為非小細胞肺癌靶向治療的目的基因，隨著科學技術的不斷成熟及臨床研究的不斷發展，有望為提高非小細胞肺癌療效提供理論依據。

[1]羅強，熊暢，熊珊，等.Pim-3在肺癌組織中的表達[J].華南國防醫學雜志，2012，26（1）：16-18.

[2]孫守亮，錢軍.pim-3基因及其相關作用[J].國際腫瘤學雜志，2012，39（2）：105-108.

[3]Fujii C,Nakamoto Y,Lu P,et al.Aberrant expression of serine and threonine kinase Pim-3 in hepatocellular carcinoma development and its role in the proliferation of human hepatoma cell lines[J].I nt J Cancer,2005,114(2)：209-218.

[4]Bachmann M,Moroy T.The serine/threonine kinase Pim-1[J].Int J Biochem Cell Biol,2008,37（4）：726-730.