不同穴組針刺后哮喘大鼠肺蛋白質(zhì)組的納升級二維液相色譜分析

洪嘉婧，洪 杰，朱重玄(韓國)，郭 航，張 夢

(長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117)

針灸治療哮喘是祖國醫(yī)學(xué)防治哮喘的常用方法之一，臨床上常用的針灸處方有辨證取穴、對癥取穴以及邵氏“三穴五針”法等[1]。本課題應(yīng)用納升級多維液相色譜技術(shù)，對照研究不同針灸穴組防治哮喘的治療效應(yīng)，分析針刺后不同針灸穴組產(chǎn)生的差異蛋白，以期闡明其效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)及其療效差異。

1 材料與儀器

1.1 試劑 乙腈(ACN)、甲酸(FA)、胰蛋白酶(Trypsin)、牛血清白蛋白(BSA)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、醋酸銨(NH4AC)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 Agilent1100納升級多維液相分析系統(tǒng)(Agilent，USA)。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量(130±30) g(吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：0001468)。將56只大鼠隨機(jī)分為7組,每組8只：A.空白對照組；B.捆綁組；C.假手術(shù)組；D.哮喘模型組；E.三穴五針組(大椎、雙風(fēng)門和肺俞)；F.郄會(huì)配穴組(膻中、雙孔最)；G.降氣平喘組(膻中、雙孔最和豐隆)。

2.2 模型復(fù)制方法 大鼠哮喘模型復(fù)制依據(jù)實(shí)驗(yàn)室方法：D、E、F、G 4組大鼠一次性腹腔注射含卵蛋白0.25 kg和氫氧化鋁凝膠0.25 kg的生理鹽水混懸液0.001 5 L以致敏；15 d后將以上4組大鼠麻醉后固定于手術(shù)臺(tái)上，行氣管插管術(shù),并經(jīng)頸外靜脈注射含卵蛋白的生理鹽水溶液以激發(fā)哮喘發(fā)作。捆綁組僅作抓取，捆綁；假手術(shù)組的腹腔注射和頸外靜脈注射均用如上等量的生理鹽水；空白對照組大鼠不做任何處理，正常飼養(yǎng)。

2.3 選穴和針刺 選穴參照大鼠常用針灸穴位定位標(biāo)準(zhǔn)[2]。針刺方法:選用15 mm/0.30 mm毫針，從造模的第1天起針刺，膻中平刺5 mm，孔最、豐隆斜刺5 mm，大椎斜刺5 mm，肺俞、風(fēng)門斜刺5 mm，各穴均捻轉(zhuǎn)10 s，每隔10 min行針1次，留針20 min，隔日治療1次，7次為1個(gè)療程。模型組和捆綁組每日同樣抓取，不針刺；空白組正常喂養(yǎng),不予處理。

2.4 樣品制備

2.4.1 大鼠肺組織蛋白提取 取大鼠左肺尖以1 g：8 mL的比例加入1 mmol/LPMSF溶液，所得勻漿冰浴混懸20 min后離心10 min，收集上清液。

2.4.2 大鼠肺組織勻漿液的總蛋白含量測定 采取Bradford法，以牛血清白蛋白作為標(biāo)品，用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量。

2.4.3 酶解反應(yīng) 將樣品用堿性水溶液調(diào)節(jié)其pH值至7.5～8后，煮沸4 min，加入15%乙腈，冷至室溫，加胰蛋白酶，使樣品與胰蛋白酶的質(zhì)量比為40∶1。37 ℃水浴條件下過夜后，滴入甲酸以終止酶解反應(yīng)，所得樣品即可上樣。

2.5 蛋白質(zhì)酶解物的納升級二維液相色譜分離 第一維強(qiáng)陽離子交換色譜柱：AgilentZORBAX，流動(dòng)相A：H2O-ACN-FA(體積比為98∶2∶0.1)。洗脫液為2 mol/L的NH4Ac,洗脫10 min，流速：10 μL/min。富集柱：C18柱為AgilentZORBAX。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SSPS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。多組之間采用單因素方差分析(One-wayANOVA)。

3 結(jié)果

3.1 模型組與空白組比較 在保留時(shí)間20～80 min之間，消失的峰為6號(hào)，新出現(xiàn)的峰為2號(hào)、8號(hào)，有可能是新物質(zhì)；提示造模成功后,哮喘組大鼠與空白組相比有新的特異性物質(zhì)產(chǎn)生，即該部分多肽可能與哮喘發(fā)病有關(guān)系。

3.2 模型組與捆綁組比較 有1個(gè)峰消失(6號(hào))，3個(gè)多肽峰的峰面積(5、7、8號(hào))有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)；提示捆綁也是一種刺激。

3.3 3個(gè)針刺組與模型組比較 1)有3個(gè)多肽峰(1、2、5號(hào))為共有峰。2)有3個(gè)多肽峰的峰面積(3、6、8號(hào))有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3)有1個(gè)新出現(xiàn)的峰(3號(hào)),可能是新物質(zhì)；提示針刺后出現(xiàn)的特異性多肽譜峰的相關(guān)蛋白可能是針刺防治哮喘的相關(guān)蛋白。

3.4 3個(gè)針刺組之間比較 1)郄會(huì)配穴組、降氣平喘組與三穴五針組相比,均有以下特點(diǎn)：共有峰5個(gè)，其中4個(gè)的峰面積(1、5、7、8號(hào))有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2)降氣平喘針法組與郄會(huì)配穴組相比，有3個(gè)多肽峰的峰面積(5、7、8號(hào))有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示采用不同配穴方法針刺后，哮喘大鼠的肺組織蛋白酶解液存在差異性蛋白表達(dá)。3)3個(gè)針刺組的共有峰(5、7、8號(hào))面積相比較，呈依次遞增的趨勢，表明采用不同配穴可影響這3種多肽的含量,并且降氣平喘組特異性多肽的峰面積最大,平喘作用最強(qiáng)，提示針刺對哮喘的治療機(jī)制可能與這3種多肽的含量有關(guān)，且含量越多，療效越好。

4 結(jié)論

針灸效應(yīng)可通過不同組織蛋白成分的變化予以監(jiān)測，nano-2D-LC技術(shù)能通過蛋白質(zhì)在種類和表達(dá)量上的改變來探討針灸治療哮喘的效應(yīng)機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)采用納升級的流速，使樣品的分離效果更好。經(jīng)過對不同檢測波長進(jìn)行考察和比較，本實(shí)驗(yàn)采用214 nm作為檢測波長。針刺體表穴位所產(chǎn)生的肺組織的特異性蛋白表達(dá)，揭示了經(jīng)穴與相應(yīng)臟腑具有特異性聯(lián)系。

[1]洪嘉婧,王富春,嚴(yán)興科,等.針灸治療哮喘的臨床取穴規(guī)律研究[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2011,27(3):372-373.

[2]林文注.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,1994:287.