不同穴組針刺后哮喘大鼠肺蛋白質組的納升級二維液相色譜分析

洪嘉婧，洪 杰，朱重玄(韓國)，郭 航，張 夢

(長春中醫藥大學，吉林 長春 130117)

針灸治療哮喘是祖國醫學防治哮喘的常用方法之一，臨床上常用的針灸處方有辨證取穴、對癥取穴以及邵氏“三穴五針”法等[1]。本課題應用納升級多維液相色譜技術，對照研究不同針灸穴組防治哮喘的治療效應，分析針刺后不同針灸穴組產生的差異蛋白，以期闡明其效應物質基礎及其療效差異。

1 材料與儀器

1.1 試劑 乙腈(ACN)、甲酸(FA)、胰蛋白酶(Trypsin)、牛血清白蛋白(BSA)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、醋酸銨(NH4AC)。

1.2 實驗儀器 Agilent1100納升級多維液相分析系統(Agilent，USA)。

2 方法

2.1 實驗動物及分組 清潔級雄性Wistar大鼠，體質量(130±30) g(吉林大學白求恩醫學院動物實驗中心提供，實驗動物合格證號：0001468)。將56只大鼠隨機分為7組,每組8只：A.空白對照組；B.捆綁組；C.假手術組；D.哮喘模型組；E.三穴五針組(大椎、雙風門和肺俞)；F.郄會配穴組(膻中、雙孔最)；G.降氣平喘組(膻中、雙孔最和豐隆)。

2.2 模型復制方法 大鼠哮喘模型復制依據實驗室方法：D、E、F、G 4組大鼠一次性腹腔注射含卵蛋白0.25 kg和氫氧化鋁凝膠0.25 kg的生理鹽水混懸液0.001 5 L以致敏；15 d后將以上4組大鼠麻醉后固定于手術臺上，行氣管插管術,并經頸外靜脈注射含卵蛋白的生理鹽水溶液以激發哮喘發作。捆綁組僅作抓取，捆綁；假手術組的腹腔注射和頸外靜脈注射均用如上等量的生理鹽水；空白對照組大鼠不做任何處理，正常飼養。

2.3 選穴和針刺 選穴參照大鼠常用針灸穴位定位標準[2]。針刺方法:選用15 mm/0.30 mm毫針，從造模的第1天起針刺，膻中平刺5 mm，孔最、豐隆斜刺5 mm，大椎斜刺5 mm，肺俞、風門斜刺5 mm，各穴均捻轉10 s，每隔10 min行針1次，留針20 min，隔日治療1次，7次為1個療程。模型組和捆綁組每日同樣抓取，不針刺；空白組正常喂養,不予處理。

2.4 樣品制備

2.4.1 大鼠肺組織蛋白提取 取大鼠左肺尖以1 g：8 mL的比例加入1 mmol/LPMSF溶液，所得勻漿冰浴混懸20 min后離心10 min，收集上清液。

2.4.2 大鼠肺組織勻漿液的總蛋白含量測定 采取Bradford法，以牛血清白蛋白作為標品，用紫外分光光度計進行定量。

2.4.3 酶解反應 將樣品用堿性水溶液調節其pH值至7.5～8后，煮沸4 min，加入15%乙腈，冷至室溫，加胰蛋白酶，使樣品與胰蛋白酶的質量比為40∶1。37 ℃水浴條件下過夜后，滴入甲酸以終止酶解反應，所得樣品即可上樣。

2.5 蛋白質酶解物的納升級二維液相色譜分離 第一維強陽離子交換色譜柱：AgilentZORBAX，流動相A：H2O-ACN-FA(體積比為98∶2∶0.1)。洗脫液為2 mol/L的NH4Ac,洗脫10 min，流速：10 μL/min。富集柱：C18柱為AgilentZORBAX。

2.6 統計學處理 應用SSPS 13.0統計軟件進行數據處理。多組之間采用單因素方差分析(One-wayANOVA)。

3 結果

3.1 模型組與空白組比較 在保留時間20～80 min之間，消失的峰為6號，新出現的峰為2號、8號，有可能是新物質；提示造模成功后,哮喘組大鼠與空白組相比有新的特異性物質產生，即該部分多肽可能與哮喘發病有關系。

3.2 模型組與捆綁組比較 有1個峰消失(6號)，3個多肽峰的峰面積(5、7、8號)有統計學意義(P<0.01，P<0.05)；提示捆綁也是一種刺激。

3.3 3個針刺組與模型組比較 1)有3個多肽峰(1、2、5號)為共有峰。2)有3個多肽峰的峰面積(3、6、8號)有統計學意義。3)有1個新出現的峰(3號),可能是新物質；提示針刺后出現的特異性多肽譜峰的相關蛋白可能是針刺防治哮喘的相關蛋白。

3.4 3個針刺組之間比較 1)郄會配穴組、降氣平喘組與三穴五針組相比,均有以下特點：共有峰5個，其中4個的峰面積(1、5、7、8號)有統計學意義。2)降氣平喘針法組與郄會配穴組相比，有3個多肽峰的峰面積(5、7、8號)有統計學意義。提示采用不同配穴方法針刺后，哮喘大鼠的肺組織蛋白酶解液存在差異性蛋白表達。3)3個針刺組的共有峰(5、7、8號)面積相比較，呈依次遞增的趨勢，表明采用不同配穴可影響這3種多肽的含量,并且降氣平喘組特異性多肽的峰面積最大,平喘作用最強，提示針刺對哮喘的治療機制可能與這3種多肽的含量有關，且含量越多，療效越好。

4 結論

針灸效應可通過不同組織蛋白成分的變化予以監測，nano-2D-LC技術能通過蛋白質在種類和表達量上的改變來探討針灸治療哮喘的效應機制。本實驗采用納升級的流速，使樣品的分離效果更好。經過對不同檢測波長進行考察和比較，本實驗采用214 nm作為檢測波長。針刺體表穴位所產生的肺組織的特異性蛋白表達，揭示了經穴與相應臟腑具有特異性聯系。

[1]洪嘉婧,王富春,嚴興科,等.針灸治療哮喘的臨床取穴規律研究[J].長春中醫藥大學學報,2011,27(3):372-373.

[2]林文注.實驗針灸學[M].上海:上海科學技術出版社,1994:287.