RP-HPLC法測(cè)定六味地黃軟膠囊中馬錢苷的含量

張?zhí)m杰，謝 程

(1.吉林省人民醫(yī)院 中醫(yī)科，吉林 長(zhǎng)春 130021；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 藥劑科，吉林 長(zhǎng)春 130033)

六味地黃軟膠囊為藥典品種六味地黃丸改劑品種，由山茱萸、牡丹皮等6味藥精制而成，具有滋陰補(bǔ)腎的功能，用于腎陰虧損，頭暈耳鳴，腰膝酸軟，骨蒸潮熱，盜汗遺精，消渴，使用該藥配合針灸對(duì)腎虛腰痛療效更佳。原標(biāo)準(zhǔn)中采用薄層掃描法測(cè)定制劑中山茱萸所含熊果酸含量，但在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，該測(cè)定方法繁瑣而不夠穩(wěn)定，故筆者參考有關(guān)文獻(xiàn)[1-3]，研究建立了六味地黃軟膠囊中馬錢苷的含量測(cè)定方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法簡(jiǎn)便、靈敏、穩(wěn)定、可靠，可作為本品的質(zhì)量控制方法。

1 儀器及試藥

儀器:島津LC-10ATvp高效液相色譜儀；島津SPD-10Avp紫外檢測(cè)器；n-2000色譜工作站(浙大智達(dá)信息工程有限公司)；梅特勒電子分析天平(上海梅特勒一托利多有限公司)。藥品與試劑：馬錢苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):111640-200503，供含量測(cè)定用)；六味地黃軟膠囊(吉林草還丹藥業(yè)有限公司，批號(hào)：090101、090102、090103；乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Aichrom Reliasil-C18(4.625 0 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.05%磷酸溶液(9∶91)；檢測(cè)波長(zhǎng)為238 nm；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。樣品中馬錢苷峰能達(dá)到基線分離，理論板數(shù)按馬錢苷峰計(jì)算，不得低于4 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取馬錢苷對(duì)照品適量，加50%甲醇制成每1 mL含40 g的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容物約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，移至具塞離心管中,密塞，離心(4 000 r/min)10 min，精密量取上清液10 mL，置中性氧化鋁柱(100～200目，3 g，內(nèi)徑1 cm，干法裝柱)上，用40%甲醇40 mL洗脫，收集流出液及洗脫液，蒸干，殘?jiān)?0%甲醇適量使溶解，并轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 取不含山茱萸的六味地黃軟膠囊陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備。

2.3 陰性對(duì)照試驗(yàn) 分別精密吸取馬錢苷對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果，供試品溶液色譜圖中，在與馬錢苷對(duì)照品溶液色譜圖相應(yīng)保留時(shí)間處有相應(yīng)的馬錢苷峰出現(xiàn)，且與臨近的色譜峰分離度大于1.5，符合《中國(guó)藥典》要求；而在陰性對(duì)照溶液色譜圖中，在與馬錢苷對(duì)照品溶液色譜圖相應(yīng)保留時(shí)間處沒(méi)有相應(yīng)的馬錢苷峰出現(xiàn)，表明處方中其它組分對(duì)馬錢苷的測(cè)定無(wú)干擾。

2.4 線性關(guān)系考察 精密稱取馬錢苷對(duì)照品適量，加50%甲醇制成80.2 g/mL的溶液，分別精密吸取2、4、6、8、10 mL，注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果：馬錢苷進(jìn)樣量在0.160 4～0.802 0 μg范圍內(nèi)，馬錢苷進(jìn)樣量與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。回歸方程Y=869 348.5X-7 983.9，相關(guān)系數(shù)r=0.999 8。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取馬錢苷對(duì)照品溶液(40 μg·mL)連續(xù)進(jìn)樣5次，每次10 μL,測(cè)定峰面積。結(jié)果，RSD為0.9%(n=5)，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在0、2、4、8 h測(cè)定1次，記錄峰面積。結(jié)果，供試品在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定，RSD為0.8%(n=4)。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)六味地黃軟膠囊樣品(批號(hào)：090101)5分,分別按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算含量。結(jié)果，平均含量0.745 7 mg/g，RSD為1.89%(n=5)。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量樣品(批號(hào)：090101，含量0.745 7 mg/g)6分，分別精密加入馬錢苷對(duì)照品溶液的儲(chǔ)備液(0.748 mg/mL)0.5 mL，按“2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率。

2.9 樣品含量測(cè)定 取樣品，按“2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各10 uL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，用外標(biāo)法(峰面積)計(jì)算含量，結(jié)果批號(hào)：20090101、20090102、20090103的每粒含量為0.282 7、0.255 3、0.2238 mg。

3 討論

在供試品溶液制備方法的選擇上，為了使樣品中馬錢苷提取完全，考察了不同提取方法(超聲與回流)、提取溶媒 (甲醇、50%甲醇、50%乙醇)及提取時(shí)間(0.5、1、1.5 h)對(duì)含量測(cè)定的影響。最后選擇最佳提取方法為樣品用50%甲醇，回流提取1 h。

在流動(dòng)相的選擇上，本試驗(yàn)分別對(duì)如下流動(dòng)相：乙腈-0.05%磷酸溶液(10∶90)、乙腈-0.05%磷酸溶液(9∶91)、乙腈-0.05%磷酸溶液(8∶92)、四氫呋喃-乙腈-甲醇-0.05%磷酸溶液(1∶8∶4∶87)進(jìn)行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在乙腈-0.05%磷酸溶液(9∶91)條件下,對(duì)于樣品中馬錢苷和其它雜質(zhì)的分離度最好，且保留時(shí)間適中，故選擇此流動(dòng)相。

[1]楊來(lái)秀,鞠愛(ài)華,溫愛(ài)平,等.HPLC測(cè)定明目地黃膠囊中的馬錢苷[J].華西藥學(xué)雜志,2007,22(4):451-453.

[2]徐桂香,楊婕,陳鐘文.HPLC法測(cè)定知柏地黃丸濃縮丸中馬錢苷的含量[J].河南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2007,22(4):30-31.

[3]馮塋.HPLC法測(cè)定濃縮六味地黃丸中馬錢苷含量[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào),2008,43(4):790.