肝毒凈丸質量標準研究

于麗雅，劉海艷，李宜平

(長春中醫藥大學院，吉林 長春 130117)

肝毒凈丸是由虎杖、紫金牛(矮地茶)、垂盆草、半枝蓮、地耳草、厚樸、敗醬草、紫草、貫眾、片姜黃10味中藥經提取、精制加工而制成的丸劑。具有清化濕熱瘀毒的作用[1-2]。用于慢性乙型病毒性肝炎濕熱瘀毒所致癥狀：肝區脹痛或刺痛，納差，脘痞，泛惡，腹脹，腿酸乏力，口干苦黏，大便或溏或秘，小便黃等。為了較好地控制該藥的質量，對方中的主要藥物虎杖、厚樸、片姜黃分別進行了定性研究，對虎杖采用高效液相色譜法進行定量分析研究。

1 儀器與試藥

LC-10ATvp高效液相色譜儀(日本島津)；SPD-10Avp檢測器；C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)；對照品均由中國藥品生物制品檢定所提供；乙腈為色譜純，水為二次重蒸水；其他試劑均為分析純。

2 定性鑒別

2.1 虎杖薄層鑒別 取本品2 g,研碎，加甲醇15 mL，時時振搖，浸泡1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取虎杖對照藥材1 g，加甲醇15 mL，同法制成對照藥材溶液。再取大黃素對照品,加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的對照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2000年版一部附錄ⅥB)試驗，吸取上述溶液各5 μL,分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)-醋酸乙酯-甲醇(10∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾干。供試品色譜中，在與對照藥材及對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，置氨氣中熏后，斑點變為櫻紅色。

2.2 厚樸薄層鑒別 取本品5 g，研碎，加甲醇30 mL，超聲處理(250 W，25 KHZ)20 min,濾過，濾液置水浴(70 ℃)上蒸干,殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液(臨用前制備)。另取和厚樸酚對照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的對照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2000年版一部附錄ⅥB)試驗，吸取上述溶液各5 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)-醋酸乙酯-甲酸(8.5∶1.5∶0.2)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；噴以2%香草醛硫酸溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。

2.3 片姜黃薄層鑒別 取本品2 g,研碎，加甲醇15 mL，時時振搖，浸泡1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取片姜黃對照藥材3 g，加水50 mL，煎煮30 min，放冷，傾出上清液置水浴上蒸干，殘渣加甲醇20 mL，超聲處理(250 W，25 KHz)5 min，濾過，濾液濃縮至約2 mL，作為對照藥材溶液。照薄層色譜法(中國藥典2000年版一部附錄ⅥB)試驗，吸取上述溶液各10 μL,分別點于同一用1%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)-醋酸乙酯-甲酸(6∶3∶0.3)為展開劑，展開，取出，晾干。噴以5%香草醛硫酸溶液，熱風吹至斑點清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。

3 含量測定

3.1 色譜條件與系統適應性試驗 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充柱；以乙腈-水(20∶80)作為流動相；檢測波長303 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL；理論塔板數按白藜蘆醇苷峰計算應不低于2 000。

3.2 溶液的制備

3.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取白藜蘆醇苷對照品適量,加甲醇溶解制成每1 mL約含10 μg的溶液，即得。

3.2.2 供試品溶液的制備 取本品適量，研碎，取約0.2 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理(250 W，25 KHz)30 min,取出，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

3.2.3 陰性溶液的制備 按處方比例稱取除虎杖以外的其余藥味,按制備工藝制成缺虎杖的陰性樣品，按上述供試品制備方法制成不含虎杖的陰性溶液。

3.3 方法學考察

3.3.1 線性關系考察 分別精密量取白藜蘆醇苷對照品溶液6、8、10、12、14、16 μL按已擬定的色譜條件測定，以峰面積為縱坐標，進樣量(μg)為橫坐標繪制標準曲線,進行線性回歸。線性回歸方程：Y=677.74X-56.227,r=0.999 9，白藜蘆醇苷在0.121 2～0.323 2 μg進樣量范圍內呈良好的線性關系。

3.3.2 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，重復進樣5次，依法測定，結果RSD%=0.56%，表明儀器的精密度良好。

3.3.3 穩定性試驗 取同一批供試品溶液進樣10 μL，分別在0、2、4、6、8 h測定，結果RSD%=0.86%，表明供試品溶液在8 h內穩定。

3.3.4 重現性試驗 精密稱取同一批樣品5分，按供試品溶液項下制備方法制備樣品溶液，測定樣品含量，結果RSD%=0.58%，表明該方法的重現性良好。

3.3.5 加樣回收率試驗 取已知含量的肝毒凈丸9分，精密稱定，按低、中、高質量濃度分別添加白藜蘆醇苷對照品適量，按供試品溶液的制備過程制成供試品溶液，按上述色譜條件測定，平均加樣回收率=98.10%，RSD%=0.98%，表明該方法的回收率良好。

3.3.6 樣品測定 分別取10批樣品，每批2分，按供試品溶液項下制備方法制備樣品溶液，測定樣品含量，結果10批樣品平均含量為42.34 mg/9 g,根據上述試驗結果以及參照仿制的肝毒凈顆粒的質量標準，暫定本品每袋(9 g)含白藜蘆醇苷不得低于32.0 mg。

4 結論

4.1 流動相的選擇 選擇乙腈-水(20：80)，白藜蘆醇苷峰保留時間在8.2 min左右，與其他色譜峰均能達到基線分離,確定為以乙腈-水(20∶80)作為流動相。

4.2 提取溶劑的選擇 按擬定的色譜條件測定，結果以甲醇作為提取溶劑時測得的含量較高。

4.3 提取時間的選擇 測定結果證明，超聲30 min和超聲40 min測得的含量接近，故選擇超聲30 min。

[1]中華人民共和國藥典委員會.中國藥典[M].北京:化學工業出版社,2010.

[2]鄭虎占,董澤宏,余靖.中藥現代研究與應用[M].北京:學苑出版社,1999.