干眼動物模型制作的研究進展

劉 莉，何慧琴

(南京市中醫院，江蘇 南京 210001)

目前在對動物實驗的研究中發現，藥物作用、環境因素、改變性激素水平、營養因素、摘除淚腺或破壞瞼板腺功能等均可導致干眼癥。干眼動物模型主要可分為淚液缺乏型和蒸發過強型2種，介紹如下。

1 淚液生成不足型干眼模型

1.1 藥物因素 研究發現，副交感神經興奮可以使淚液分泌增加，如果阻斷神經興奮，就可以降低淚液分泌,阿托品是一種常用的副交感神經受體阻斷劑。施煒等[1]利用1%阿托品滴眼液，以4次/d的方式給兔點眼，在7 d后兔的淚流量達到最低點，直到第14天淚流量基本無明顯異常，角膜染色檢查在11 d內角膜熒光素染色增加，但用藥14 d后角膜熒光素染色與用藥前相比，則差異不大，實驗結果說明隨著時間的延長，干眼癥狀表現越不明顯，這種方法不能使觀察對象長期維持在一個理想狀態，不可用于長期的實驗觀察。東莨菪堿是從莨菪類植物中提取的具有抗膽堿活性的生物堿，與阿托品的中樞作用強的特點不同，氫溴酸東莨菪堿是一種外周作用較強的抗膽堿藥。仇晶晶等[2]在兔的皮下注射氫溴酸東莨菪堿誘導兔淚液分泌減少，給藥后1 h,實驗組淚液分泌量明顯減少，在實驗早期藥物完全代謝之后，發現淚腺分泌量下降程度有限，持續給藥的高劑量組第14天出現淚液分泌量明顯下降，并且隨用藥時間延長，淚液分泌量減少更為顯著。結果提示造模過程中，淚腺分泌功能的改變與注射藥物的劑量密切相關，2.0 mg/次,每天注射4次的給藥模式可有效維持氫溴酸東莨菪堿的外周濃度，從而抑制淚腺的分泌，導致干眼的發生。這種方法在持續給藥后期，會出現淚液黏液蛋白膠層的破壞，淚膜穩定性下降，在眼表無法形成完整淚膜，進而發生角膜上皮點狀脫失。這說明了皮下注射氫溴酸東莨菪堿引起的干眼以出現的淚流量的減少為主,并且伴有免疫性炎癥和細胞凋亡影響干眼模型。李晶等[3]使用高滲鹽水分別對對照組采用308 mOsmol/L氯化鈉溶液點眼,每日5次，實驗組采用500 mOsmol/L氯化鈉溶液點眼，每日5次，空白組不點眼方式造模，第0天各組間比較無統計學意義，第7天起，小鼠出現淚液生成明顯減少(P<0.05),角膜熒光素鈉染色和虎紅染色出現點、片狀著色，角膜熒光素鈉染色評分升高[3組分別為(0.9±1.2)、(0.5±0.7)、(1.4±1.6)，P<0.01]，淚液蕨類圖形減少。第14天起，與空白組和對照組相比，實驗組小鼠結膜杯狀細胞計數減少[3組分別為(10.6±2.0)、(11.8±1.3)、(5.4±1.8)，P<0.01]。角膜上皮基底部細胞排列紊亂缺失，角膜上皮分層減少，出現空泡，角膜上皮層厚度減少[3組分別為(21.69±3.41)、(21.23±2.64)、(15.82±1.38)μm,P<0.05]，角膜上皮細胞微絨毛丟失。第42天后，Shirmer實驗觀察較第0天下降66%，角膜熒光素染色從第7天起實驗組染色評分比第0天上升了75%,總體觀察淚液滲透壓升高可以在小鼠眼表引起類似于干眼的病理損害。

1.2 手術造模 李森等[4]利用水合氯醛將大鼠全身麻醉后,在左耳下方約1 cm處沿皮紋做橫切口，暴露皮下見一微黃色圓形腺體(眶外淚腺)，分離周邊包膜將其完整摘除后縫合，再將左眼外側1 cm處做縱行切口，暴露皮下見一白色質硬膜，切開見下方一三角形腺體(眶內淚腺)，將其完整摘除后縫合，術后1周Shirmer試紙濕長呈下降趨勢,術后2周與術前比較有顯著差異，熒光素染色自術后2周開始較術前明顯升高，至術后4周更為明顯穩定，說明干眼模型制做成功。在目前的實驗研究中，“去勢”是常見的一種降低性激素的方法，此法主要通過睪酮水平降低，淚腺上皮細胞萎縮,杯狀細胞減少而產生干眼。姚小磊等[5]在造模過程中，將實驗兔固定后，經腹正中切口逐層切開進入腹腔，切除雙側卵巢，對照組不切除卵巢只打開腹腔，術后連續縫合腹壁各層，45 d后觀察發現,實驗組BUT時間縮短、Shirmer試驗減少、淚膜穩定性降低以及局部炎性反應因子和細胞凋亡相關基因蛋白表達增強、IL-1β與TNF-α大量表達于細胞膜和細胞漿中。這種方法簡單易行，完全符合干眼癥的病理表現。Zhu等[6]切除一側淚腺，并在切除的淚腺的上皮細胞中培養自體外周血淋巴細胞5 d后，然后把自體外周血淋巴細胞注入兔的另一側淚腺中，2周后誘導出類似于人類Sjogren綜合征的自身免疫干眼癥狀。這說明了這些自體外周血淋巴細胞是起到抗原提呈細胞作用，其中主要是CD4+T細胞的炎性浸潤作用，但是這種方法操作復雜,且對兩側淚腺造成嚴重損害,不利于自身的對照。王建倉等[7]在實驗中用0.05 kg/L氯胺酮對12只雄兔進行肌肉注射全身麻醉，在雄兔陰囊皮下加用2%利多卡因局部麻醉，先后將雙側睪丸由腹腔擠入陰囊并捏緊，用消毒刀片將陰囊切一小口，且用力擠出睪丸，結扎精索靜脈及輸精管，切除睪丸及附睪，連續縫合后局部涂碘酊預防感染。術后8周后,動物模型的Schirmer試驗、淚膜破裂時間差異性極顯著，第12周后觀察發現，動物模型的Schirmer試驗、淚膜破裂時間、虎紅染色檢查均有明顯干眼表現，但由于雄性激素水平的異常極易導致腺泡細胞表達自身抗原，引起炎癥反應。

1.3 營養因素 維生素A的缺乏也可以出現干眼，維生素A中含有視黃酸、視黃醛、視黃醇等活性衍生物,可以維持正常視力和免疫系統。馬軼群等[8]使用以干酪素為主的完全不含VitA的飼料喂干眼病模型組兔子，6個月后，實驗組兔子的角膜干燥無光澤，Schirmer實驗組兔顯示均<10 mm，對照組兔均>20 mm。淚膜破裂時間顯示實驗組兔均<12 s，對照組兔均>24 s，實驗表明，缺少維生素A可導致淚腺腺體萎縮，角膜上皮及結膜干燥引發干眼癥。

2 蒸發過強型干眼模型

2.1 藥物因素 Jester等[9]通過每天(約3次)對實驗兔局部滴用腎上腺素，持續半年以上，兔的瞼板腺導管才會出現角化，導致瞼板腺導管狹窄或閉塞，淚液不能正常排出，從而出現瞼板腺功能障礙。這種造模方式往往需要較長的時間，且成功率較低。黃佳等[10]用1.0 mmol/L的氫氯化鈉溶液燒傷兔結膜后，其淚液分泌量未見明顯變化，杯狀細胞密度和黏蛋白含量在28天內有明顯差異，淚膜破裂時間第7天下降明顯,后逐漸延長，熒光和虎紅染色術后第1天最明顯，后逐漸下降。從實驗結果來看,這種造模方式，癥狀持續時間較短，不常用于長期的實驗觀察。

2.2 減少瞬目頻率 劉盛春等[11]在實驗中分別用兩個鐵夾夾住實驗兔雙眼上眼瞼正中近瞼緣處毛發，并用絲線相互固定以此控制其瞬目運動。按同定時間(由實驗前1 h瞬目次數的1/3計算)人為的使各兔瞬目1次，雙眼操作相同，每天8 h(8:00～12:00，14:00～18:00)，其余時間待其休息進食，持續14 d，室內溫度保持在20～23 ℃，相對濕度保持在40±10%，室內無明顯噪音及氣流干擾。14 d后，比較實驗A組與對照C組，28天后觀察實驗B組，發現實驗A組7 d和實驗B組3 d淚流量明顯減少,從第3天起，實驗A、B組有大量的角膜熒光染色,BUT時間縮短，該模型主要通過減少瞬目頻率，使淚液蒸發過多，淚液中黏蛋白缺乏，眼表組織繼而干燥失活，角膜上皮細胞壞死缺損，由此引起角膜上皮屏障功能的損害而出現干眼的表現。

2.3 破壞瞼板腺功能 Gifford等[12]采用灼燒封閉家兔瞼板腺開口,導致瞼板腺口堵塞，脂質不能正常排出，引起淚膜脂質層異常，從而形成干眼癥。王曉冬等[13]在實驗中，用燒灼器逐個燒灼模型組上下瞼緣處所有瞼板腺開口,每個開口燒灼時間約2 s燒灼后，摘除兔的第三眼瞼，使淚液蒸發過強，淚膜不穩定，無法對眼表起到保護作用。這種方法對眼表的損害較大，可能造成瞼板腺功能的不可逆性的破壞，而影響治療瞼板腺功能障礙藥物療效的觀察。以上2種方法雖然制作過程簡單，但是可能因為燒灼的溫度和面積的大小，而對眼表組織產生不同程度的損害，影響淚腺的穩定性，不利于觀察藥物對瞼板腺的治療作用。

3 結語

目前，干眼癥的發病機制尚未完全明確，且發病率較高，想要徹底根治比較困難，所以干眼癥的動物實驗研究是非常必要的。上述的幾種動物模型的制作方法都各有其優缺點，實驗人員應該根據自己的實驗目的和實驗條件選擇合適的動物模型。雖然在制作干眼動物模型上有了很大的突破與改進，但是在制作過程中仍存在著許多的不穩定因素，急待我們去思考與研究，成功的制作出符合實驗要求的動物模型，對于干眼的動物實驗研究具有重大意義。

[1]施煒,李橋,王育良,等.阿托品滴眼液制作兔干眼模型的研究[J].臨床眼科雜志,2011,19(5):455-457.

[2]仇晶晶,袁進,周世有,等.皮下注射氫溴酸東莨菪堿建立兔干眼模型的實驗研究[J].眼科,2009,18(6):404-409.

[3]李晶,付川,謝漢平.高滲鹽水點眼制作的小鼠干眼模型與評估[J].第三軍醫大學學報,2010,32(11):1183-1187.

[4]李森,張林.大鼠淚液缺乏型干眼癥眼表組織中IL-6和TNF-α的表達[J].國際眼科雜志,2010,10(7):1281-1283.

[5]姚小磊,彭清華,吳權龍,等.圍絕經期性激素水平下降導致干眼癥兔模型的建立[J].湖南中醫藥大學學報,2009,29(3):9-12.

[6]Zhu Zejin,Stevenson D,Schechter J E,et al.Lacrimal histopathology and ocular surface disease in a rabbit model of autoimmune dacryoadenitis[J].Cornea,2003,22(1):25-32.

[7]王建倉,卞小蕓,宋秀君,等.去勢雄兔干眼模型淚液分泌和淚膜穩定性的改變及局部雄激素治療效果觀察[J].河北醫藥,2008,30(5):590-592.

[8]馬軼群,楊青,于海濤.維生素A缺乏兔干眼病模型角膜上皮細胞凋亡及相關蛋白表達的關系[J].眼科新進展,2008,28(8):586-589.

[9]Jester J V,Nicolaides N,Kiss-palvolgyi I,et al.Meibomian gland dysfunction.II.The role of keratinization in a rabbit model of MGD[J].Investigative Ophthalmology & Visual Science,1989,30(5):936-945.

[10]黃佳,楊水平,陳敏,等.結膜堿性燒傷致干眼模型的探討[J].廣東醫學,2008,29(5):753-755.

[11]劉盛春,吳曉梅.減少瞬目頻率建立的蒸發過強型兔干眼模型[J].國際眼科雜志,2009,9(7):1265-1268.

[12]Gifford P,Evans BJ,morris J A.clinical evaluation of systane[J].Contact Lens & Anterior Eye:the Journal of the British Contact Lens Association,2006,29(1):31-40.

[13]王曉冬,盛敏杰,林安娟.燒灼瞼板腺開口并摘除第三眼瞼制作兔瞼板腺功能障礙性干眼模型的評價[J].眼科研究,2010,28(9):827-830.