紅三葉異黃酮抗氧化功能及其藥理作用研究進展

師旭彤，郭鳳霞，祁 娟

（1.山東大學藥學院，山東 濟南 250012；2.甘肅農業大學 生命科學技術學院，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅農業大學 草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中－美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070）

紅三葉（Trifoloium pratense）又名紅車軸，是豆科三葉草屬（Trifolium）多年生草本植物。原產于歐洲和西亞，現廣泛分布于世界各地，中國東北、華北、華南地區均有栽培。紅三葉含有黃酮類、蛋白質、氨基酸、糖類和維生素等多種具有價值的成分，尤其是異黃酮因有植物雌激素樣作用和黃酮類物質的抗癌作用而備受關注。20世紀40年代以來，有關紅三葉異黃酮有效成分及療效的研究日益受到重視，已開發出藥品和保健食品達百余種。目前，紅三葉異黃酮的提取物是國際上公認的治療婦女更年期綜合癥療效顯著的植物性藥，其銷量在美國多年來一直名列前十位［1］。

甘肅省岷縣一帶已形成規范化種植基地，在地區特色經濟發展和土壤輪作倒茬改良中起到積極作用。但人們對紅三葉的藥用價值和保健價值認識尚不全面。本文對紅三葉異黃酮的抗氧化性及在防治疾病上的應用情況進行綜述，以期對國內一些科研及醫藥生產單位更好地開發利用提供理論依據。

1 紅三葉的形態特征及生物學特性

紅三葉為豆科多年生草本植物，高30～80cm，側根發達，莖直立或斜升，葉互生，三出復葉，小葉橢圓狀卵形至寬橢圓形，葉緣有不明顯的細齒，小葉無柄；花序腋生，頭狀，具大型總苞，總苞卵圓形；花萼筒狀，花冠蝶形，淡紅色、紫色或淡紫紅色；莢果小，包被于萼內，含種子1粒，橢圓或腎形，棕黃色或紫色，千粒質量為1.5g［2－5］?；ㄆ?～10月，紅三葉為2倍體植物。

紅三葉適宜在我國亞熱帶高山低溫多雨地區種植，喜溫暖濕潤氣候，最適宜生長在夏天不太炎熱，冬天溫暖，年降水量1 000mm的地區。生長最適溫度為15～25℃，能耐－8℃低溫。無霜期150～220d，生長良好。喜中性至微酸性土壤，適宜的pH為5.5～7.5。紅三葉原產于歐洲和西亞，現在歐洲各國及澳大利亞、新西蘭、美國等國廣泛栽培［4］。在我國新疆、云南、貴州、浙江、湖北、江蘇等省均有野生分布［6］。目前，紅三葉有許多適應不同環境的優良品種［7］。并且研究發現各個時期異黃酮含量均以葉片中最高，花次之，然后是根，莖、葉柄和托葉［8］。

2 紅三葉異黃酮種類

自20世紀50年代開始，人們對紅三葉植株的化學成分進行了大量的研究，已分離鑒定了異黃酮、黃酮、蛋白質、氨基酸、糖類、揮發油和維生素等多類化合物［9］。但最受關注的是黃酮類物質，其中，具有“植物雌激素”之稱的異黃酮類格外受人關注。異黃酮是一種廣泛存在于植物界的一大類化合物，目前，植物中已知的異黃酮有700余種，主要存在于大豆、紅三葉、苜蓿等豆科植物，尤以紅三葉中異黃酮的含量最高［10］。從50年代以來，Pope、Bate－Smith、Guggolz等科學家先后從紅三葉植株中分離到許多異黃酮類物質［11－13］，其中，以鷹嘴豆芽素A（Biochanin A），芒柄花素（Formononetin），染料木素（Genistein），大豆苷元（Daidzein）等4種為主［14］。

3 紅三葉異黃酮的抗氧化作用

3.1 對脂質過氧化作用

紅三葉異黃酮可以抑制膜質過氧化。異黃酮能保護DNA不被氧化破壞，有效消除紫外線引起的DNA損傷［15］。異黃酮還能抑制小鼠肝組織勻漿液中脂質的過氧化作用，能防止 Vc的氧化［16］。姜義寶等［17］通過在飼料中添加紅三葉異黃酮，研究其對肉雞免疫器官、免疫球蛋白及抗氧化性能的影響，發現紅三葉異黃酮提高了血清中谷胱甘肽過氧化物酶活性，降低了丙二醛（MDA）含量，能夠明顯改善肉雞生產性能、調節免疫和提高機體的抗氧化性。

3.2 清除自由基的傷害

活性氧和自由基是引發人體衰老、癌變和細胞損傷的重要原因。紅三葉中含有大量的具有潛在的生物抗氧化和良好的清除自由基功能的異黃酮多酚化合物，且其清除能力與異黃酮的種類和含量有一定的關系。紅三葉提取物中的異黃酮和多酚化合物具有良好的生理健康促進作用，被認為是有效的抗氧化劑、自由基清除劑和功能食品增補劑［18］。在血紅蛋白與過氧化氫所致的卵磷脂過氧化試驗中，大多異黃酮均有抑制作用，其中，染料木素和芒柄花素有強抑制作用，其抑制作用與抗氧化劑、維生素E和SOD相當［19］。朱宇旌等［7］研究證實，添加紅三葉黃酮粗提物對豬油具有良好的抗氧化作用，另外Vc和VE等對紅三葉黃酮粗提物具有明顯的協同抗氧化作用。

3.3 提高抗氧化酶的活性

紅三葉異黃酮還可提高抗氧化酶的活性。試驗表明，紅三葉異黃酮可顯著提高小腸、皮膚等器官的抗氧化酶數量，誘導機體抗氧化活性升高。楊麗珍等［20］用紅三葉異黃酮高、低劑量及大豆異黃酮、倍美力組對比治療衰老大鼠實驗，說明紅三葉異黃酮通過提高SOD活性，降低MDA濃度，達到提高機體清除氧自由基能力，從而有效延緩衰老。魏朝良等［21］對黃酮類化合物及清除自由基機制的探討發現，紅三葉異黃酮具有較強的抗氧化性與分子結構具有密切關系，黃酮類化合物抗氧化作用是通過酚羥基與自由基反應形成穩定半醌式自由基結構，在一定程度上增加酚羥基，抗氧化活性增加。

大量研究表明，紅三葉異黃酮提取物對消除自由基和抑制脂質過氧化均有較強作用，能有效延緩油脂脂質過氧化，表現出一定的抗氧化活性。目前，對紅三葉異黃酮抗氧化活性的研究，多集中在其幾種單體的研究，而對紅三葉總黃酮抗氧化及體外清除自由基及其抗氧化效果如何有待進一步研究。

4 紅三葉異黃酮的藥理作用

4.1 發揮雌激素樣作用

目前國內外學者對紅三葉研究最多的就是其雌激素樣作用。紅三葉異黃酮為植物雌激素，結構與人體雌激素類似，可與雌激素接受器相互作用。專家認為，可能是由于異黃酮的雙羥基酚式結構與動物體內雌激素己烯雌酚和雌二醇結構相似，故能選擇性的與雌激素受體結合發揮雌激素樣作用。紅三葉異黃酮作為唯一植物雌激素有其獨到之處，他們具有雙向調節作用，當人體雌激素水平高時，可抑制激素分泌，反之，當人體雌激素水平低時，能提供額外的雌激素樣作用。臨床上既用來治療婦女體內雌激素水平升高時的經前期綜合癥，又被用于治療雌激素降低時的更年期綜合癥和絕經［22－26］。另外，也能治療雌激素病，例如子宮肌瘤、子宮內膜異位及骨質疏松癥等。紅三葉中發揮這種雌激素樣功能的化合物主要有鷹嘴豆芽素A、芒柄花素、染料木素和大豆黃素，其中，染料木素活性最強，和雌激素受體的結合力也最強，大豆苷元次之，芒柄花素活性和與受體的結合能力最弱，鷹嘴豆芽素A無結合力，但有弱雌激素活性，異黃酮甲基化或糖苷化后會使活性降低［4，5］，紅三葉積累刺芒柄花素的能力最高，并且自真葉的愈傷組織異黃酮含量最高［27，28］。此外，香豆雌酚也具有雌激素樣作用［29］。人體補充紅三葉異黃酮可以預防和治療激素分泌失調導致的一系列相關疾病。Potter等［30］用異黃酮和雌二醇來抑制或預防婦女由于內源性雌激素減少而引起或加重的疾病如骨質疏松、認知功能喪失、體重增加、身體脂肪量增加、血管收縮癥狀等。Kelly等［31］用含芒柄花黃素和大豆苷元的藥劑或膳食補充物來預防和治療面頰熱、睡眠紊亂等。另據報道，異黃酮植物雌激素也被認為是一種特殊的營養物質并對家畜的生產性能可能存在潛在的影響，即能夠替代抗生素和相關激素等生長促進劑，而成為養殖業研究的一個熱點［32］。

4.2 減輕動物機體更年期綜合癥

近年來研究發現絕經期綜合癥（PMS）有發病年齡提前、發病率上升的趨勢。楊麗珍等［33］研究了紅三葉異黃酮對更年期大鼠下丘腦β－內啡肽的作用，表明紅三葉異黃酮具有改善更年期雌性大鼠下丘腦β－EP神經元功能，從而起到穩定內環境和緩解的作用。同時發現，紅三葉異黃酮能顯著改善婦女更年期綜合征。更年后期婦女潮熱的發病率，在歐洲和北美高達70%～80%，而在日本、中國和東南亞國家，則分別為25%，18%和14%。這種差異是由于這些國家人們攝入的植物雌激素水平不同所致。有的學者認為紅三葉異黃酮在治療絕經期婦女熱潮紅能減少熱潮紅發生頻率；而有些學者則認為植物雌激素如大豆提取物，紅三葉提取物不能改善熱潮紅或其他絕經期癥狀［13］。這一問題需要進一步進行驗證。

4.3 提高動物機體免疫能力

異黃酮能提高動物機體細胞免疫、體液免疫。秦亮［34］研究紅三葉和紅芪兩種中草藥提取物對小鼠免疫功能和肉雞生產性能的影響時發現，適量的紅芪粗多糖和紅三葉總黃酮提取物能夠增強小鼠非特異性免疫、細胞免疫和體液免疫功能，促進免疫器官的發育。劉寶劍［35］對紅三葉總黃酮抗氧化作用及其對免疫功能的影響研究發現紅三葉總黃酮在適宜濃度范圍內具有增強小鼠免疫功能的作用。

4.4 防止鈣流失及骨質疏松

骨質疏松癥是一種與年齡、性別和激素缺乏相關的疾病。更年后期婦女卵巢雌激素分泌量的急劇減少是引起骨質中鈣流失和骨質疏松的首要原因。研究發現植物雌激素異黃酮具有預防骨吸收和增加骨密度的作用。紅三葉異黃酮對維甲酸致小鼠骨質疏松有一定的預防作用，其機制可能與其減緩雌激素水平降低，抑制骨高轉換有關［36］。李穎等［37］對紅三葉異黃酮對去卵巢大鼠骨質疏松防治作用的實驗研究發現，紅三葉異黃酮對去卵巢引起的大鼠骨質疏松癥具有明顯的防治作用。有關異黃酮預防骨質疏松的機制，現在認為，異黃酮作為較弱的雌激素激動劑或拮抗劑，與破骨細胞內的受體結合后抑制其破骨活動和骨吸收過程，加速骨形成過程。陳琦等［38］研究結果表明，紅三葉異黃酮通過提高血清雌激素水平，增加成骨細胞活性，降低骨高轉換率以及減少骨量丟失等多種途徑，能有效防治絕經后骨質疏松癥。寧鴻珍［39］等研究紅三葉異黃酮對去卵巢大鼠骨密度及骨代謝的影響，結果表明紅三葉異黃酮不僅可以維持去卵巢大鼠骨密度，而且可以替代雌激素對骨代謝有一定的調節作用。

4.5 防治心腦血管性疾病

近年來對于紅三葉異黃酮降膽固醇的研究取得了一定的進展，國外一些研究在這方面申請了多項專利。Empie等［40］從紅三葉、苜蓿等植物原料中提取出異黃酮、皂甙等化學成分，然后把它們按一定比例混合，用混合物治療心臟血管性疾病如血液膽固醇過高、心臟病、血管功能異常。Atkinson等［41］研究紅三葉異黃酮對心血管風險因子的作用，認為飲食中補充紅三葉衍生物對更年期婦女心血管風險因子有一定的保護作用。Nestel等［42］實驗顯示攝入紅三葉異黃酮，對改善全身組織動脈血管的順應性來減少冠心病冠狀動脈硬化性心臟病的風險因素有顯著的效果。劉紹東等［43］用紅三葉提取液對實驗性高脂血癥大鼠血脂的影響進行研究，紅三葉提取液能明顯降低高脂血癥大鼠的血脂以及血漿AngⅡ和ET水平，可能對高脂血癥和動脈粥樣硬化癥有防治作用。

4.6 防治癌癥

紅三葉提取物能通過抑制相關酶類等多種途徑而發揮抗癌作用。研究表明，人體攝入動物性激素可誘發或加劇癌癥的發生，但若補充植物性激素則可以抑制癌細胞的繁殖并且可以消滅癌細胞。Empie等［37］從紅三葉、苜蓿等植物原料中提取出異黃酮、皂苷等化學成分，制成的混合物治療前列腺癌、皮膚癌、乳腺癌、結腸癌、尿道癌等。Roberts D W等［44］研究表明，鷹嘴豆芽素A和（或）芒柄花素可通過直接競爭細胞色素結構發揮抗癌作用或間接通過它們的代謝產物大豆黃素和染料木黃酮抑制CYP1B1而發揮抗癌作用。Mizunuma等［45］用兩種異黃酮（鷹嘴豆芽素A、大豆黃素），通過小鼠乳房腫瘤病毒誘導的自發乳腺癌細胞模型來驗證異黃酮的抗癌作用，認為系統的抗癌效果可能不是通過大豆黃酮或牛尿酚，而是鷹嘴豆芽素A或染料木黃酮，這兩種物質在腸道微生物群的代謝過程中可能扮演了一個抑制乳腺癌的角色。Slater等［46］研究，在飼喂紅三葉異黃酮小鼠的前列腺上皮細胞顯示雌激素β受體和上皮細胞鈣粘蛋白顯著的增加，表明紅三葉異黃酮對于前列腺增生能減少潛在的致瘤性轉化Renea等［47］研究表明，飲食中添加紅三葉異黃酮可以通過誘導前列腺癌細胞的凋亡抑制前列腺癌的發展。尹春萍等［48］研究紅三葉總異黃酮對人乳腺癌MCF－7細胞增殖和凋亡的影響發現，紅三葉總異黃酮可抑制MCF－7細胞增殖并誘導其凋亡，具有抗腫瘤作用。

4.7 預防肥胖癥

據統計數字顯示，25%的美國人和27%的加拿大人的體重超標。肥胖尤其上部軀體肥胖會誘發高血壓、胰島素排斥等疾病。Ingram等［49］用含異黃酮的合成物治療肥胖癥，避免了其他減肥藥品因含有咖啡因和安非他刺激物加重心臟肌肉和血管的負擔，帶來不利影響。該合成物通過抑制食欲，攝入少量食物使胃具有飽感來治療肥胖。

4.8 保護皮膚免受紫外線傷害

皮膚受到紫外線照射會引起表皮細胞DNA和T型淋巴細胞免疫系統的損壞。若長期暴露于紫外線照射下會引發癌癥。異黃酮作為一種遮光劑，具有良好的保護皮膚、修復損傷的作用。紅三葉富含牛尿酚異黃酮，它能保護皮膚免受紫外線的輻射并能抑制皮膚癌的形成［50］。Kelly等［51］用含有芒柄花黃素、雞豆黃素、染料木黃酮、二氫染料木黃酮等載體混合制成的產品來保護皮膚免受紫外線照射造成的傷害。

紅三葉異黃酮具有毒性低，藥理作用眾多等優點。不但在預防和治療動脈硬化、骨質疏松、更年期癥狀、癌癥等方面得到廣泛應用，而且在調節激素平衡、抗自由基、抗菌、消炎、降血壓等多方面也發揮著巨大作用。最近的研究發現，紅三葉異黃酮還可以防止味精等食品添加劑對身體健康的破壞。另外，異黃酮類化合物在畜牧業上也有廣闊的應用前景，是一種值得推廣的飼料添加劑。隨著對紅三葉異黃酮生理功能研究的不斷深入，人們也在不斷地擴大它的應用領域，但尚需要對它進行更加深入的研究，如對異黃酮類化合物長期過量使用是否具有毒性等方面。紅三葉的保健食品和醫藥產品已大量進入國際市場，但國內對這方面的研究還相對較少。因此，有必要對該屬植物進行更全面、更深入的研究，充分發掘它們的潛在利用價值，從而為人類帶來更大的經濟效益和社會效益。

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